電針“委中”穴對大鼠腰多裂肌損傷后TGF-β1、CTGF、Vimentin表達的影響?

魯 曼 徐 菁 李欣怡 陳 莉 陳 潔

張佳怡1 許 玥1 白玉琢1 張 莉1△ 劉 通2△

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.廣東省第二中醫院，廣東 廣州 510095）

腰痛是臨床治療中最常見的癥狀之一，多見于腰背部區域疼痛不適，可沿臀部放射至大腿部，嚴重者出現麻木、沉重、酸軟、乏力等伴隨癥狀。有研究發現［1］，慢性腰痛反復發生的原因可能有兩點：腹部和腰背部核心肌肉群力量減小以及脊柱穩定性功能降低。多裂肌是人體重要的核心肌群之一，它位于脊柱兩旁內側，能夠協助脊柱完成側彎、旋轉、前后屈伸等動作，由于其獨特結構，在維持脊柱穩定性方面有關鍵作用［2］。針刺治療腰痛在臨床上已經得到普遍認可，是臨床治療腰痛常用的方法之一［3-6］。本課題組前期研究表明［7］，電針委中穴能夠加速肌衛星細胞增殖的周期性進程，進而促進多裂肌的損傷修復，肌纖維再生和結締組織生長因子的協調作用對肌肉修復具有重要的影響。本實驗目的是觀察電針委中穴對多裂肌修復過程中轉化生長因子-β1（TGF-β1）、結締組織生長因子（CTGF）、波形纖維蛋白（Vimentin）的表達變化，進一步研究電針委中穴對骨骼肌修復過程中肌纖維再生以及纖維化因子的影響，并且找到針灸治療的最佳療程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，8周齡，54只，體質量（280±20）g，購于北京維通利華實驗動物中心［許可證號：SCXK（京）2016-0006］，所有大鼠隨機分籠飼養，進食和飲水不受限，適應性喂養7 d，明暗周期各12 h，環境溫度24℃，濕度40%～50%。

1.2 試劑與儀器 主要試劑：布比卡因（美國Sigma公司）；10%水合氯醛（北京歐北生物）；16%多聚甲醛溶液（北京雷根生物）；Masson三色染色試劑盒（北京So?larbio公司）；TGF-β1抗體，CTGF抗體和Vimentin抗體（美國proteintech公司）；山羊抗兔IgG（北京鼎國昌盛）；抗體稀釋液（北京鼎國昌盛）；DAB顯色液（北京鼎國昌盛）。主要儀器：韓式電針儀（北京思盛達醫療器械中心）；半自動化石蠟切片機（北京弘泰嘉業）；電熱恒溫培養箱（黃石恒豐）；顯微鏡及成像軟件系統（日本奧林巴斯株式會社）。

1.3 分組與造模 采用完全隨機數字表法將54只大鼠分為空白組、模型組和電針委中組，每組18只，各組再隨機分為3個時間點（治療1、3、7 d），每個時間點6只。除空白組不做任何處理外，其余各組以10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）腹腔注射進行麻醉，操作過程必須在無菌的環境下，然后剔除大鼠腰背部毛發，找到大鼠L4、L5水平棘突對應兩側的4個點進針，針頭緊貼棘突旁進入肌肉，直到觸及關節突和乳突所在的骨面后再回抽無血時，以每個點100 μL注入0.5%布比卡因溶液，且時間不得短于3 s，這樣更加有利于藥物的吸收。

1.4 干預方法 空白組不進行任何處理。電針委中組在造模后24 h進行治療，將大鼠固定在實驗室操作桌上，暴露出雙側后肢的腘窩部，找到委中穴（膝關節背面正中的位置），用一次性針灸針（華佗牌，0.30 mm×13 mm）直刺3 mm，再接上韓式電針儀，采用2～100 Hz的疏密波，電流1 mA，每日治療1次，每次治療20 min。模型組造模后不做治療，只需與電針委中組同步進行固定。

1.5 標本采集與檢測 各組大鼠分別在治療1、3、7 d后進行取材，用10%水合氯醛溶液進行腹腔注射，大鼠完全處于麻醉狀態下后，將其固定在鼠板上，充分暴露背部，剔除背毛，剪開皮膚，剝離開筋膜、肌肉，銳性切取L4～5水平的多裂肌，左側迅速放于液氮中固定，隨后-80℃進行保存，右側置于4%多聚甲醛溶液中進行固定。1）Masson染色觀察多裂肌形態學變化。右側多裂肌在4%多聚甲醛溶液中固定好后，石蠟包埋，組織切片。將切片放在二甲苯中進行脫蠟處理，然后用梯度乙醇和蒸餾水水洗；Weigert鐵蘇木素染色5 min；酸性乙醇分化10 s；藍化液返藍3 min；蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色5 min；弱酸工作液洗1 min；磷鉬酸洗1 min；再用弱酸工作液洗1 min；苯胺藍染色2 min；弱酸工作液洗1 min；梯度乙醇脫水數次；二甲苯透明；中性樹膠進行封片。最后借助顯微鏡在鏡下觀察各組多裂肌組織形態的變化。2）免疫組化法（IHC）檢測TGF-β1、CTGF、Vimentin的表達。將切片放在65℃環境下烤片處理15 min，然后二甲苯脫蠟兩次，15 min/次；梯度乙醇脫水（100%，90%，75%，50%）；高壓鍋熱抗原修復處理；PBS沖洗；滴加雙氧水室溫下孵育15 min；滴加正常非免疫血清，37℃下孵育30 min封閉；滴加一抗后4℃孵育過夜（TGF-β1按照1∶200稀釋，CTGF按照1∶200稀釋，Vimentin按照1∶1 000稀釋）；滴加山羊抗兔IgG（1∶25稀釋），37℃下孵育40 min；滴加DAB顯色工作液，然后在顯微鏡下觀察，出現棕黃色后可隨時終止反應；蘇木素（1∶25稀釋）復染10 min，；脫水透明，中性樹膠進行封片。在顯微鏡下觀察采集圖像，然后用Image Professional Plus 6.0軟件進行圖像分析處理。

1.6 統計學處理 應用SAS8.2統計軟件。計量資料以（）表示。數據服從正態分布，組間差異用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗處理。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠的腰多裂肌組織形態學變化 見圖1。空白1、3、7 d組可見到大量紅染的肌纖維整齊排列；模型組可見散狀、星點、不規則分布的紅色肌纖維，而藍色的膠原纖維則大量分布；針刺委中組與模型組相比，可以見到被紅染的肌纖維，而藍色的膠原纖維則相對減少。

圖1 各組大鼠腰多裂肌組織形態結構（Masson染色，200倍）

2.2 各組大鼠腰多裂肌組織中TGF-β1表達水平比較 見表1，圖2。治療1、3、7 d時，同時間點模型組與電針委中組TGF-β1的表達均高于空白組（P<0.01），與模型組相比，同時間點電針委中組的表達有所減少（P<0.01）。

表1 各組大鼠腰多裂肌中TGF-β1表達水平比較（MOD值，±s）

表1 各組大鼠腰多裂肌中TGF-β1表達水平比較（MOD值，±s）

與空白組比較，?P<0.05，??P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。下同

組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.038±0.016 0.091±0.016**0.067±0.009**△△3 d 0.056±0.008 0.101±0.007**0.076±0.006**△△7 d 0.050±0.007 0.094±0.007**0.075±0.011**△△

圖2 各組大鼠不同時間點腰多裂肌TGF-β1表達（免疫組化染色，200倍）

2.3 各組大鼠腰多裂肌組織中CTGF表達水平比較見表2，圖3。治療1 d時，與空白組比較，模型組與電針委中組的CTGF表達有所上升（P<0.01或P<0.05）；與模型組比較，電針委中組的表達量減少（P<0.05）。治療3 d時，模型組表達量高于空白組（P<0.01），電針委中組表達量也高于空白組，但差異無統計學意義（P>0.05），與模型組比較，電針委中組的表達量更低（P<0.05）。治療7 d時，模型組與電針委中組表達量高于空白組（P<0.01），且電針委中組的表達量顯著低于模型組（P<0.01）。

表2 各組大鼠腰多裂肌中CTGF表達水平比較（MOD值，±s）

表2 各組大鼠腰多裂肌中CTGF表達水平比較（MOD值，±s）

組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.057±0.016 0.105±0.017**0.080±0.012*△3 d 0.054±0.015 0.090±0.019**0.066±0.006△7 d 0.043±0.012 0.132±0.033**0.089±0.017**△△

圖3 各組大鼠不同時間點腰多裂肌CTGF表達（免疫組化染色，200倍）

2.4 各組大鼠腰多裂肌組織中Vimentin表達水平比較 見表3，圖4。治療1 d時，模型組與電針委中組的Vimentin的表達量較空白組增加（P<0.01），與模型組比較，電針委中組的表達量較模型組增加（P<0.01）。治療3 d時，與空白組比較，模型組與電針委中組表達量明顯上升（P<0.01）；電針委中組的表達量比模型組更高（P<0.01）。治療7 d時，模型組與電針委中組表達量顯著高于空白組（P<0.01），與模型組比較，電針委中組的表達量有所上升（P<0.05）。

表3 各組大鼠腰多裂肌中Vimentin表達水平比較（MOD值，±s）

表3 各組大鼠腰多裂肌中Vimentin表達水平比較（MOD值，±s）

組別空白組模型組電針委中組n 6 6 6 1 d 0.052±0.016 0.082±0.007**0.119±0.016**△△3 d 0.037±0.012 0.077±0.007**0.118±0.007**△△7 d 0.044±0.012 0.084±0.008**0.104±0.017**△

圖4 各組大鼠不同時間點腰多裂肌Vimentin表達（免疫組化染色，200倍）

3 討 論

在全世界范圍內，約有80%的人群患有慢性腰痛。腰痛癥狀輕重不一，嚴重者會影響工作、學習以及生活各個方面，其中大約25%的患者會選擇就醫［8］，以減輕不適感。有研究表明，腰痛患者中大部分存在多裂肌萎縮［9］以及脂肪浸潤［10］，而且浸潤程度與年齡增長呈正相關，這與多裂肌的分布位置和本身具有的獨特結構，以及維持腰椎穩定性功能有關。有研究報道，布比卡因作為局麻藥起效迅速，而且與給藥部位有關，3種藥物相比，布比卡因最容易引起肌肉的毒性，而且它導致的凋亡細胞數量最多［11］；在運動阻滯效應方面，它所起的效果明顯高于另外兩種藥物［12］。本實驗大鼠模型制備選擇肌肉注射0.5%布比卡因溶液，是因為它的效應具有選擇性，只會影響肌纖維而并不改變基底膜以及細胞的再生能力，而且0.5%布比卡因起到阻滯作用的同時，不具有任何血流動力學副作用［13］，不影響與骨骼肌修復再生能力相關的其他因素。實驗證明損傷后24 h介入電針治療是多裂肌修復的最佳時機［14］，因此本實驗選擇干預時機為造模后24 h，觀察多裂肌修復過程中，不同治療療程組大鼠多裂肌肌纖維的表達變化。

TGF-β1可以通過激活衛星細胞，調節結締組織再生，改變免疫反應強度這幾個方面來參與骨骼肌的損傷修復［15］，而骨骼肌萎縮是TGF-β1調節的病理狀態之一［16］，會出現肌肉力量減弱和肌肉質量下降的表現。有研究證明［17］，TGF-β1能夠促進成纖維細胞進行增殖，進而誘發肌肉纖維化發展。謝慧等［18］研究發現電針干預可以抑制TGF-β1/Smad3信號通路，緩解腓腸肌萎縮的進程，加速肌衛星細胞的分化，促進骨骼肌纖維再生修復。仝樂［19］研究表明電針穴位之后，TGF-β1的表達降低，細胞外基質的沉淀會減少，肌纖維的再生與修復能力能夠得到促進。實驗結果顯示，治療1 d和3 d時，電針委中組TGF-β1的表達比模型組減少（P<0.01），說明了TGF-β1在損傷修復過程中被抑制，細胞外基質沉淀減少，進而促進肌肉修復。電針委中組治療7 d時，和3 d時的表達維持在同一水平線上，幾乎沒有差異，這說明電針委中穴治療能夠在多裂肌損傷修復的早期發揮抑制肌肉纖維化因子的作用，進而促進肌衛星細胞的增殖與分化，減少損傷肌肉修復過程中的負效應。

CTGF是結締組織生長因子，器官組織的纖維化發展與其有密切的關系。現有研究表明［20］，作為促組織纖維化蛋白，當機體組織處于損傷情況下時，CTGF會大量分泌，而且與皮膚瘢痕形成、血管粥樣硬化、損傷修復障礙、器官組織纖維化發展具有一定的聯系［21］。孫桂蓮等［22］研究表明，CTGF的表達增強與進行性肌肉營養不良患兒的肌肉萎縮纖維化關系密切，在纖維化過程中發揮了重要作用。吳珍元等［23］研究表明不同強度電針刺激可以抑制靶器官的結締組織再生，減輕失神經骨骼肌萎縮程度，從而防止纖維化。治療1 d和3 d時，同時間點電針委中組與模型組相比CTGF的表達減少（P<0.05），治療7 d時，電針委中組的表達低于模型組（P<0.01），同時電針委中7 d組比電針委中3 d組表達增加，這說明電針在抑制結締組織生長因子的過程中，3 d組的抑制能力最強，隨后減弱。

Vimentin作為一種細胞骨架蛋白，是肌肉損傷修復病理學研究領域的新發現［24］。有研究表明［25］，在肌肉再生的早期過程中，Vimentin能夠促進肌衛星細胞的激活，在肌肉損傷修復方面發揮著重要的作用。治療1 d和3 d時，與模型組相比，電針委中組Vimentin的表達增加（P<0.01），治療7 d時，電針委中組與模型組之間也有明顯差異（P<0.05），但7 d時電針委中組表達低于治療3 d時。這說明在電針委中的干預過程中，治療3 d時，損傷肌肉恢復的效果達到最佳。

“腰背委中求”，是歷代醫家經驗的總結，從古至今，一直是針灸醫生臨床選穴治病的理論支持。足太陽膀胱經的經絡循行路線經過脊柱兩側，并且到達腰部，其中一分支從臀部穿過到達腘窩處，即委中穴所在的位置；足太陽膀胱經與足少陰腎經相表里，二者分布于下肢外側后緣和內側后緣，且腰為腎之府；足太陽經筋起于足小趾，沿跟腱向上止于腘窩部，因此委中穴既是膀胱經的合穴、下合穴，也是足太陽經筋其中一分支的結所在；委中穴位于腘橫紋的中點處，解剖位置在股二頭肌肌腱與半腱肌肌腱之間，從脊髓節段角度而言，腰背部神經節段與委中穴的傳入神經分布有相互重疊的部分，會互相影響。以上幾點從中醫角度說明“經脈所過，主治所及”的原則、特效穴和特殊穴的運用，以及從西醫角度解釋委中穴的解剖位置以及委中穴與腰痛神經節段的相關性，為臨床治療腰痛提供了可靠的依據。

綜上所述，本實驗研究表明，電針委中穴可以通過下調TGF-β1和CTGF的表達，同時增加Vimentin的表達，來促進損傷骨骼肌的修復，從肌纖維再生的角度說明，電針委中穴治療骨骼肌損傷病變，最佳治療時長可能是持續3 d，與肌肉纖維化相關的因子在此刻能得到最大效力的針刺抑制作用，此時骨骼肌修復的效果達到最優。