電針干預對功能性消化不良大鼠下丘腦CRF及其受體的影響?

金 恒 凌家艷△ 徐派的

（1.湖北省武漢市第一醫院，湖北 武漢 430022；2.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430061）

功能性消化不良（FD）是一種無器質性病變的胃腸疾病，其發病機制主要與胃腸運動障礙、腦腸互動異常、腸道菌群失調、內臟敏感性增高、腸道低度炎癥、精神心理因素等密切相關，其中因生活工作壓力等精神心理因素致病率較高［1-2］。促腎上腺皮質激素釋放因子（CRF）可在外周及中樞分泌，是重要的神經內分泌肽。研究發現［3］，有焦慮、抑郁行為的大鼠部分腦區CRF水平增加，當給大鼠注射外源性CRF制劑時會引起焦慮樣行為。因此，CRF及其受體與精神因素相關。本實驗探究CRF及其受體在FD發病中的作用，探討FD的發病機制，為針刺治療FD提供實驗依據?，F將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠36只，體質量180～220 g，購于湖北省醫學科學研究院實驗動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。將其飼養于湖北中醫藥大學實驗中心SPF動物房。室溫22～25℃，相對濕度50%～70%。在明暗12 h交替光照環境中適應性喂養7 d后開始實驗。本實驗所有操作均符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的各項規定。

1.2 試劑及儀器 1）試劑：CRF、CRF-R1、CRF-R2、β-actin抗體（美國Abcam公司）；磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；水合氯醛（上海國藥集團公司）。2）儀器：HAMS-200A穴位神經刺激儀（南京濟生醫療科技有限公司），針灸針（規格：直徑0.22 mm，長25 mm，中研太和一次性無菌針灸針），垂直電泳槽、電轉儀（北京六一儀器廠），全自動酶標儀（美國賽默飛世爾公司），離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），曠場實驗箱（上海欣欣），自制大鼠鼠衣及懸掛大鼠裝置。

1.3 分組及造模 將36只大鼠隨機分為正常組12只，造模組24只。采用改良夾尾法+0℃生理鹽水灌胃+不規則飲食法同時干預建立FD大鼠模型［4-5］。具體方法如下：用尖端纏繞厚膠布的止血鉗夾住大鼠尾巴末端1/3處，令大鼠尖叫、站立并與同籠大鼠互相廝打。鉗夾大鼠尾部以不破皮為度。若有皮損注意隨時用5%皮膚消毒劑消毒。于每日9∶00及15∶00兩個時間段各夾尾1次，每次持續30 min。每次夾尾結束后用0℃ 0.9%氯化鈉注射液灌胃，每只2 mL，每日2次。同時逢單日禁食，雙日給予300 g飼料，自由飲水。以上干預持續2周。若大鼠出現毛發雜亂、發黃，大便稀溏、惡臭，反應遲鈍，喜蜷縮等癥狀后，隨機選取兩只大鼠解剖發現無腹部異常、胃腸潰瘍等器質性病變，表明造模成功。造模過程中，正常組正常飲食，同造模大鼠一樣實施抓取，不進行夾尾及0℃生理鹽水灌胃等操作。造模結束后，成模大鼠分為模型組11只，電針組11只。

1.4 干預方法 電針組在造模結束后第2天開始干預。將大鼠穿上自制鼠衣固定于鼠架后，參照《實驗針灸學》［6］“足三里”（即大鼠“后三里”）及“太沖”穴定位。75%酒精棉球消毒后用針灸針直刺2～8 mm，分別將兩側“足三里”穴及“太沖”穴接HAMS-200 A電針儀，參數設置為連續波，頻率2 Hz，電流強度1 mA，每次干預30 min，每日1次，連續干預14 d。正常組、模型組不予干預，但是在電針組干預期間行同樣抓取、穿鼠衣、鼠架懸掛固定。

1.5 曠場實驗 參照文獻［7］的方法進行曠場試驗，每只大鼠當日測定1次，觀察時間為3 min。保持實驗室安靜、適宜室溫（22～25℃）及適宜光線強度。觀測指標：根據攝像機記錄的視頻來記錄大鼠水平運動格數、中央格停留時間及垂直站立的次數。

1.6 標本采集與檢測 采用Western blotting檢測CRF、CRF-R1、CRF-R2的表達。處死大鼠，將下丘腦組織加入細胞蛋白裂解液提取蛋白，提取總蛋白之后用酶標儀測定蛋白濃度。配置8%的SDS-PAGE凝膠，加樣后恒壓電泳跑膠，隨后恒流轉膜。加入5%的脫脂奶粉封閉過夜，分別加CRF、CRF、CRF-R1、CRFR2抗體后孵育2 h。清洗3次后加二抗，再次孵育2 h，顯色，暗室曝光，用Quantity One軟件分析。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間均數比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠曠場實驗結果比較 見表1。與正常組比較，模型組大鼠水平運動格數、垂直運動次數及中央格停留時間均顯著減少（P<0.01）。與模型組相比較，電針組大鼠水平運動格數、垂直運動次數及中央格停留時間顯著增加（P<0.01）。提示模型組大鼠焦慮抑郁狀態嚴重，經電針干預后大鼠焦慮抑郁情況明顯減輕。

表1 各組大鼠曠場實驗結果比較（±s）

表1 各組大鼠曠場實驗結果比較（±s）

與正常組比較，?P<0.01；與模型組比較，△P<0.01。下同

組 別n 水平運動（格）垂直運動（次）中央格停留時間（s）正常組模型組電針組12 11 11 104.23±2.19 72.93±5.16*98.34±7.15△10.24±1.34 4.65±2.26*9.09±1.23△7.56±1.67 2.12±1.03*5.87±2.18△

2.2 各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的表達比較 見表2，圖1。與正常組比較，各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1表達增多，CRF-R2表達減少。電針干預后，與模型組比較，CRF、CRF-R1表達減少，CRF-R2表達增多。因此電針可下調下丘腦CRF，CRF-R1的表達，上調下丘腦CRF-R2的表達。

3 討論

隨著生活及工作壓力增加，人們都存在不同程度的情緒障礙，嚴重影響生活質量，增加社會醫療負擔。已有實驗證明，心理疾病及精神障礙等因素是FD的關鍵發病機制之一［8］。根據FD的癥狀，中醫學將其歸于“胃脘痛”“痞滿”范疇，本病病位在胃，涉及肝脾。多為肝氣郁滯，疏泄失職，橫逆乘脾犯胃，脾胃升降失常，久則肝脾耗傷，脾失健運，運化無力。據調查發現，肝郁脾虛證是FD主要病機［9］，因此，本研究采用復合因素干預造模，對大鼠胃腸形成慢性刺激，耗損脾胃之氣，久之脾胃之氣虛弱。另外夾尾法使大鼠暴怒后，郁怒傷肝，綜合辨證則為肝郁脾虛型FD。根據大鼠從易怒、反應快速至逐漸出現毛色枯黃、大便稀溏、喜蜷臥等癥狀，加之無器質性病變作為模型評價標準。

表2 各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的相對表達含量比較（±s）

表2 各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的相對表達含量比較（±s）

組別正常組模型組電針組n 12 11 11 CRF/GAPDH 0.43±0.05 0.91±0.02*0.51±0.05△CRF-R1/GAPDH 0.45±0.04 1.01±0.02*0.63±0.02△CRF-R2/GAPDH 1.11±0.01 0.46±0.35*0.69±0.03△

圖1 各組大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2蛋白的表達

現階段，因西藥副作用大、療效不確定、個體差異性大等因素導致FD西藥療法具有較大局限性。而中醫療法獨具特色，副作用小，因此逐漸被廣大醫師及患者接受。電針療法屬于中醫療法。研究表明［10-12］，電針治療FD療效確切。因肝郁脾虛證為FD發病的主要病機，因此采用疏肝健脾為基本治則。本研究選取的足陽明胃經合穴足三里可健脾益氣，增強脾胃運化，降逆理氣，是治療胃腸道疾病的要穴，同時足三里為強壯穴，可滋后天生化之源以養先天。選取足厥陰肝經原穴太沖可疏郁結之肝氣，調暢氣機。二者配合以達健脾疏肝，通暢胃腑之功。

CRF家族中有CRF配體（CRF、Ucn1、Ucn2等）及CRF受體（CRF-R1、CRF-R2），其通過配體受體結合發揮多種效應。CRF是由41個氨基酸組成的重要神經內分泌肽，主要分布于中樞神經系統（如下丘腦）及外周組織（如胃腸道），在下丘腦室旁核表達較高［13］。CRF調控多種神經、內分泌、免疫等反應，通過激活促腎上腺皮質激素釋放因子受體（CRFR），在神經系統、消化系統、皮膚系統、內分泌系統等方面均發揮重大作用，能調控神經內分泌、炎性反應、行為及精神改變等［14］，是機體重要的神經遞質。CRF發揮其生理作用主要是通過與其受體結合而實現的，CRF受體中CRF-R1、CRF-R2具有生物學活性，參與CRF的大部分生物效應［15］。腦內CRF主要與CRF-R1結合產生效應，CRF-R1在哺乳動物中樞神經系統中廣泛分布，通過調控丘腦-垂體-腎上腺軸而調節促腎上腺皮質激素、糖皮質激素的分泌［14］，CRF-R2主要在外周分布，參與調控機體能量平衡［16］。研究表明，CRF-R1具有促進焦慮、抑郁發生作用，而CRF-R2具有抗焦慮抑郁作用［17］。

本研究進行曠場實驗，從行為學角度評價各組大鼠焦慮抑郁情況；另外采用Western blotting檢測大鼠下丘腦CRF、CRF-R1、CRF-R2表達，從蛋白水平評價電針干預下FD大鼠的發病機制。本研究結果發現，與模型組比較，電針干預后大鼠水平運動格數、垂直運動次數、中央格停留時間顯著增加，提示電針干預可減輕大鼠焦慮抑郁狀態。大鼠下丘腦CRF、CRF-R1表達降低而CRF-R2表達升高，提示電針干預可調節CRF及其受體的平衡。因此，根據本實驗結果所示，電針可能是通過下調下丘腦CRF、CRF-R1，上調CRF-R2來減輕大鼠焦慮樣行為治療FD，且CRF-R1、CRF-R2之間的平衡與FD發病相關，從心理及精神因素角度揭示FD發病機制及電針療法對FD的作用機制。本課題組下一步會阻斷CRF受體，開展觀察大鼠焦慮樣行為是否變化等一系列實驗來進一步探究電針治療FD的機制。