骨傷康顆粒對(duì)兔橈骨骨折模型VEGF、NO及ALP表達(dá)的影響?

黃孝斌 黃 河 楊宏泉

（湖北省洪湖市人民醫(yī)院，湖北 洪湖 433200）

橈骨骨折是臨床常見(jiàn)的骨折之一，多由暴力、累積性勞損等因素造成。骨折愈合是指骨折斷端間的組織修復(fù)反應(yīng)，是恢復(fù)骨的正常結(jié)構(gòu)和正常功能的愈合反應(yīng)。骨折愈合是目前骨科康復(fù)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，加速骨折愈合是醫(yī)學(xué)界的重要課題［1-2］。西醫(yī)多采用物理因子治療，效果不明顯。中醫(yī)藥治療骨折歷史悠久，療效良好，具有顯著優(yōu)勢(shì)，多以活血化瘀藥為主［3］。骨傷康顆粒具有活血祛瘀、消腫止痛之功效，用于骨折、脫臼與軟組織扭挫傷，在我院取得良好的臨床療效。本研究通過(guò)建立兔橈骨骨折模型，探討骨傷康顆粒對(duì)橈骨骨折家兔血清血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）、一氧化氮（NO）、血清堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)的影響，旨在為臨床提供治療參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)新西蘭白兔，體質(zhì)量（2.80±0.50）kg，雌雄各半，購(gòu)于上海邦耀生物科技有限公司。動(dòng)物置于（23±2）℃室溫中，晝夜節(jié)律，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)環(huán)境7 d后于9∶00～17∶00進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 骨傷康顆粒為本院協(xié)定處方，其組成為：丹參15 g，三七9 g，紅花、當(dāng)歸尾、甘草各6 g。藥材均為本院中藥房提供，加8倍量水煎煮2次，濾過(guò)，濃縮成0.25 mg/kg的煎煮液，放涼后待用。傷科接骨片（大連美羅中藥廠有限公司）、青霉素（石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司）、3%戊巴比妥鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供。VEGF、NO、ALP ELISA試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)于天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉注射液由山東康寧藥業(yè)有限公司提供（批號(hào)：07112133），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。東方紅F30-IIF200max X線攝片機(jī)（北京醫(yī)用射線機(jī)廠），WDW-100萬(wàn)能電子材料試驗(yàn)機(jī)（深圳市凱強(qiáng)利試驗(yàn)儀器有限公司），TD5A-WS/TD5AWS型低速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限公司）、DPX-IQ型雙光子骨密度測(cè)定儀（日本OLYMPUS公司），超低溫冰箱（冠森生物科技（上海）有限公司），電子天平（上海良平儀器有限公司），控溫水浴箱GKC（上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 分組與造模 家兔隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、骨傷康組，每組15只。各組家兔在自然光線下，以標(biāo)準(zhǔn)飼料和無(wú)菌蒸餾水喂養(yǎng)。空白組未經(jīng)任何處理，其余各組家兔參考文獻(xiàn)［4］制定兔橈骨骨折模型：3%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈麻醉家兔后，剪去前腿腿毛，消毒后，切開(kāi)皮膚暴露橈骨，采用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)制造橈骨骨折模型，不予固定，縫合傷口。3 d后肌肉注射40萬(wàn)U青霉素鈉，每日1次。分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)進(jìn)食。

1.4 給藥方法 建模成功后，陽(yáng)性組給予傷科接骨片0.5 g/kg灌胃，骨傷康組給予骨傷康顆粒灌胃，劑量2.5 g/kg，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，均每日1次，連續(xù)4周。

1.5 觀察指標(biāo) 1）X線表現(xiàn)：4周后，拍攝橈骨正側(cè)位X線片，觀察骨缺損區(qū)的骨痂和骨連接情況，進(jìn)行X線肉眼評(píng)價(jià)。“±”表示骨質(zhì)正常；“+”表示骨折處斷開(kāi)清晰，無(wú)骨痂陰影；“++”表示骨折斷處形成纖維骨痂，呈云霧狀陰影；“+++”表示骨折斷處骨痂生長(zhǎng)豐富，骨折線接近消失；“++++”表示骨折斷處完全連接，接近骨化。2）骨密度和骨礦含量的測(cè)定：X線檢測(cè)后，采用DPX-IQ型雙光子骨密度測(cè)定儀測(cè)量骨缺損區(qū)新骨的骨密度以及骨礦含量。生物力學(xué)檢測(cè)：取家兔右側(cè)橈骨標(biāo)本，用萬(wàn)能電子材料試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行整骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，跨距40 mm，加載速度為5 mm/min，最大載荷為20 kg，采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)描記橈骨的載荷，變形曲線以及抗彎強(qiáng)度。3）VEGF、NO及ALP水平檢測(cè)：采取血清，雙抗體夾心-ELISA法定量測(cè)定VEGF，比色法間接測(cè)定血清中的NO濃度，直接法檢測(cè)血清ALP含量，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)；組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組家兔X線評(píng)分比較 見(jiàn)表1，圖1。4周后，X線片結(jié)果顯示陽(yáng)性組和骨傷康組兔的骨痂密度、骨缺損填充度以及骨痂量明顯好于模型組，兩組兔的X線評(píng)分明顯高于模型組（P<0.05），但兩組間比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。

表1 各組兔橈骨的X線評(píng)分結(jié)果比較（n）

圖1 各組家兔橈骨骨折X線圖像

2.2 各組家兔生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。4周后，模型組生物力學(xué)指標(biāo)明顯低于空白組（P<0.05），給予藥物治療后，陽(yáng)性組和骨傷康組生物力學(xué)指標(biāo)明顯升高，明顯高于模型組（P<0.05）。

表2 各組兔橈骨的生物學(xué)性能測(cè)定情況比較（±s）

表2 各組兔橈骨的生物學(xué)性能測(cè)定情況比較（±s）

與陽(yáng)性組比較，◇P<0.05。下同

組別空白組模型組陽(yáng)性組骨傷康組n 15 15 15 15最大載荷（N）245.00±20.50 112.37±24.38*183.03±15.01*△203.24±20.14*△◇彎曲位移（mm）5.12±0.87 2.28±0.26*3.98±0.42*△4.65±0.67*△◇彈性模量（mPa）357.06±31.47 183.24±23.36*259.37±3.59*△275.64±34.12*△◇

2.3 各組家兔骨礦含量和骨密度比較 見(jiàn)表3。4周后，模型組兔橈骨的骨礦含量以及骨密度明顯低于空白組（P<0.05），給予藥物治療后，陽(yáng)性組和骨傷康組兔橈骨的骨礦含量以及骨密度明顯升高，明顯高于模型組（P<0.05），兩組間比較具有明顯差異（P<0.05）。

表3 各組兔橈骨的骨礦含量及骨密度比較（±s）

表3 各組兔橈骨的骨礦含量及骨密度比較（±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性組骨傷康組n 15 15 15 15骨礦含量（mg）501.25±38.27 327.28±20.76*416.98±29.02*△473.85±32.67*△◇骨密度（mg/cm2）180.32±19.47 125.24±9.66*157.37±13.59*△169.64±14.12*△◇

2.4 各組兔血清VEGF、NO及ALP表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。4周后，模型組兔的血清VEGF和ALP水平明顯高于空白組，血清NO水平明顯低于空白組（P<0.05）。給予藥物治療后，陽(yáng)性組和骨傷康組VEGF和ALP水平明顯低于模型組，血清NO水平明顯高于模型組（P<0.05），兩組間的血清VEGF、NO及ALP水平比較具有明顯差異（P<0.05）。

表4 各組兔血清VEGF、NO及ALP表達(dá)水平比較（±s）

表4 各組兔血清VEGF、NO及ALP表達(dá)水平比較（±s）

組別空白組模型組陽(yáng)性組骨傷康組n 15 15 15 15 VEGF（pg/mL）63.26±6.09 87.32±7.24*72.18±7.05*△68.75±5.94*△◇NO（μmol/L）54.53±7.67 19.52±3.85*43.76±5.54*△47.95±6.46*△◇ALP（pg/mL）55.14±4.59 90.43±13.12*74.62±11.74*△65.43±10.62*△◇

3 討 論

橈骨骨折可引起骨折部位局部變形腫脹、劇痛以及瘀血等情況，可限制患者運(yùn)動(dòng)，嚴(yán)重影響其日常生活。VEGF為促血管形成因子，不僅能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管重建，還能夠增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活性，其他促血管生成因子的血管重建作用的實(shí)現(xiàn)均與VEGF有關(guān)［5］。ALP主要由成骨細(xì)胞分泌，可反映成骨細(xì)胞的成骨能力［6-9］。NO是一種細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，與骨組織細(xì)胞的功能密切相關(guān)，影響骨折愈合［10-12］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨折后血瘀積于經(jīng)脈不散，致使經(jīng)脈受阻，影響骨折愈合的速度，治療應(yīng)活血化瘀。骨傷康顆粒以活血化瘀藥為主，現(xiàn)代藥理學(xué)顯示，丹參有效成分丹參酮ⅡA、丹參素、丹酚酸B和兒茶醛等，可促進(jìn)骨形成、間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨折愈合、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖，抑制破骨細(xì)胞和抗骨組織以及無(wú)機(jī)元素代謝紊亂的作用。當(dāng)歸有效成分可直接作用于骨髓細(xì)胞，改善血細(xì)胞的生產(chǎn)環(huán)境，并有顯著的止血止痛作用。三七有效成分三七總皂苷能有效抑制骨折后血液高凝狀態(tài)，保護(hù)血管內(nèi)皮，增加骨組織中b-FGF和VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。紅花有效成分紅花黃色素可降低血漿黏稠度，有效抑制血小板聚集，降低血小板內(nèi)游離鈣離子濃度，促進(jìn)骨折患者圍術(shù)期炎性反應(yīng)因子的清除［13-15］。

本研究中，治療4周后，X線片結(jié)果顯示陽(yáng)性組和骨傷康組兔的骨痂密度、骨缺損填充度以及骨痂量明顯好于模型組，模型組最大載荷、彎曲位移以及彈性模量明顯低于空白組，給予藥物治療后，X線評(píng)分明顯高于模型組，陽(yáng)性組和骨傷康組生物力學(xué)指標(biāo)明顯升高，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示骨傷康顆粒可提高橈骨骨折的生物力學(xué)指標(biāo)，促進(jìn)骨折愈合。4周后，模型組兔橈骨的骨礦含量、骨密度以及血清NO水平明顯低于空白組，血清VEGF和ALP水平明顯高于空白組，給予藥物治療后，陽(yáng)性組和骨傷康組兔橈骨的骨礦含量、骨密度以及血清NO明顯升高，明顯高于模型組，血清VEGF和ALP水平明顯低于模型組，兩組間比較具有明顯差異（P<0.05）。提示骨傷康顆粒可提高骨礦含量、骨密度以及血清NO水平，降低血清VEGF和ALP水平。

綜上所述，骨傷康顆粒可有效促進(jìn)兔橈骨骨折愈合，其機(jī)制可能與降低血清VEGF和ALP表達(dá)，提高NO水平有關(guān)。