寬胸理肺湯聯合三子養親湯治療AECOPD的GC-TOFMS血清代謝組學研究?

張 瑞 黃慶松 趙稼螢 黃雪元

（上海市嘉定區中醫醫院，上海 201800）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種慢性非特異性炎癥性疾病［1］。痰濁壅肺證是COPD急性加重期（AECOPD）的最主要證型之一。寬胸理肺湯是上海中醫藥大學附屬龍華醫院方邦江教授治療痰濁壅肺型AECOPD經驗方，筆者在臨床上應用寬胸理肺湯聯合三子養親湯治療AECOPD取得了更好的臨床療效［2］。本研究運用氣相色譜-飛行時間質譜聯用（GC-TOFMS）技術觀察寬胸理肺湯聯合三子養親湯治療AEOCPD痰濁壅肺證患者的血清代謝產物變化，同時構建相關代謝通路，從代謝層面研究中藥復方的可能作用機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 1）診斷標準：西醫診斷標準和病情嚴重程度分級參照2016年GOLD診斷標準［3］；中醫辨證分型標準按照《中藥新藥臨床研究指導原則》［4］。2）納入標準：符合西醫診斷標準同時符合中醫辨證標準的患者，患者氣流受限程度根據2016年慢性阻塞性肺疾病全球倡議［3］納入GOLD 2～3級，能夠完成肺功能檢測，第1秒用力呼氣量（FEV1%）為30%～80%，吸入支氣管舒張劑后FEV1/用力肺活量（FVC%）<70%，且年齡60～80歲，病情在1周內急性加重期；經上海市嘉定區中醫醫院倫理委員會審查批準，所有受試者均簽署知情同意書。3）排除標準：COPD并發呼吸衰竭且需要機械通氣者；因肺結核、支氣管哮喘、肺部腫瘤、肺間質纖維化、支氣管擴張等原因導致的慢性咳喘患者；發病時有嚴重的心功能不全，肝、腎功能不全者，造血系統等諸臟器功能不全疾病和精神疾病者。

1.2 臨床資料 選取2017年4月至2019年4月上海市嘉定區中醫醫院門診及住院AECOPD患者60例，經中醫辨證為痰濁壅肺證，采用隨機、平行對照方法設計，按隨機數字表將60例患者納入治療組和對照組各30例。另為進行代謝組學檢測對照，本研究共納入同期在筆者所在醫院體檢中心體檢的健康受試者30名，年齡60～80歲。治療組男性14例，女性16例；平均年齡（66.20±7.13）歲；病情嚴重程度GOLD 2 級19例，GOLD 3級11例；平均病程（16.77±6.09）年；平均BMI（21.26±3.17）kg/m2；合并高血壓病者17例，2型糖尿病者16例，冠心病者10例。對照組男性16例，女性14例；平均年齡（65.47±8.43）歲；病情嚴重程度GOLD 2級17例，GOLD 3 級13例；平均病程（17±6.19）年；平均BMI（21.82±2.87）kg/m2；合并高血壓者15例，2型糖尿病者17例，冠心病者11例。兩組性別構成、年齡、病情嚴重程度、病程、BMI、合并癥等方面資料比較，差異均無統計學意義（均P>0.05）。

1.3 治療方法 納入研究的AECOPD患者均按照診治指南［5］進行治療。對照組為西醫基礎治療：吸氧、祛痰、平喘、抗感染等。治療組在對照組基礎上加用寬胸理肺湯聯合三子養親湯：麻黃9 g，杏仁12 g，法半夏9 g，全瓜蔞30 g，薤白12 g，橘紅6 g，茯苓15 g，甘草6 g，桃仁10 g，蘇子10 g，地龍9 g，白芥子 10 g，萊菔子 10 g。每日1劑，由筆者所在醫院中藥房煎制，分兩次口服，每次100 mL，7 d為1個療程，總共觀察1個療程。

1.4 標本采集和制備 治療后兩組患者及健康人群于清晨6∶00左右在室溫下釆取靜脈4 mL，留置于EDTA管中，血液樣本在室溫下自然凝固1 h，收集血清，3 000 r/min離心10 min后收集血漿置于1.5 mL Eppendor f管中，置于液氮萃取后轉運至-80℃冰箱中保存備用。

1.5 標本檢測和分析 代謝組學的檢測和分析與上海百趣生物科技有限公司共同完成，包括樣品的處理、GC-TOFMS測試和數據處理分析。1）儀器：Agilent 7890A GC-MS色譜儀；PEGASUS HT質譜儀，LECO；DB-5MS色譜柱，Agilent；Heraeus Fresco17冷凍離心機，Thermo Fisher Scientific；Forma 900 series超低溫冰箱，Thermo Fisher Scientific。2）試劑：甲醇，CNW Tech?nologies；氯仿、吡啶、甲氧胺鹽、L-2-氯苯丙氨酸、BST?FA及各化合物標準品，Adamas；FAMEs，REGIS Tech?nologies；純水由Merck Millipore系統制備。3）樣品處理：100 μL血清加入 4倍體積冷甲醇，再加入 10 μL L-2-氯苯丙氨酸沉淀蛋白，離心取上清液低溫減壓干燥；各樣本分別取40 μL混合，制備混合血清進行質量控制（QC），按相同方法進行前處理；提取物用30 μL甲氧胺鹽試劑，80℃孵育30 min后向每個樣品中加入40 μL BSTFA溶解，70 ℃孵育90 min；之后加入5 μL FAMEs（溶于氯仿），隨機順序上機檢測。4）分析條件：采用DB-5MS（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱；進樣口溫度280℃，不分流模式，進樣量1 μL，載氣（高純氦）流速為3 mL/min；柱箱升溫程序為50℃保持1 min后，以10℃/min升至310℃，保持8 min。質譜采用標準EI離子源，電離電壓-70 eV，離子源溫度250℃，在全掃描模式下采集數據，質量范圍（m/z）50～500，掃描速率12.5 spectr/s。

1.6 統計學處理 應用ChromaTOF軟件（V 4.3x，LECO）對質譜數據進行分析，應用LECO-Fiehn Rtx5數據庫對物質定性，匹配質譜及保留時間指數，將QC樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。得到的峰表輸入Simca 15.0.2件進行主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）。通過置換檢驗，200次隨機改變分類變量Y的排列順序，得到不同的隨機Q值后對模型有效性做進一步的檢驗。按照VIP>1，T檢驗（T-Test）P<0.05的條件進行質荷比的篩選后，通過檢索在線數據庫（KEGG、HMDB、PubChem）定性可能的差異性代謝物。最后對差異代謝物所在的通路進行綜合分析、篩選（包含富集分析和拓撲分析），找到與代謝差異物相關性最高的關鍵通路。

2 結 果

2.1 各組PCA結果比較 見圖1。治療后兩組患者與健康組基本處于95%置信區間，治療組、對照組與健康組主要成分得到了分離，說明各組間代謝物存在顯著差異；從得分圖可見治療組與健康組有靠攏趨勢，與對照組有一定差異，說明治療后治療組與健康組代謝產物接近。

圖1 各組PCA得分散點圖

2.2 各組OPLS-DA及對模型的驗證比較 見圖2。治療后兩組患者與健康組的血清樣品OPLS-DA圖中，樣本處于95%置信區間，治療組與對照組、健康組分布區域完全分離，說明治療組與對照組能對患者的代謝情況產生影響，且各組代謝情況存在差異。R2Y非常接近1，Q2非常接近1，表明當前模型較為真實可靠，適合解釋各組之間的代謝差異和發現各組之間的差異性代謝物。置換檢驗建立對應的OPLS-DA模型獲得隨機模型的Q2值均小于原模型的Q2值；置換的Y變量比例增大，表面模型具有良好的穩健性，擬合良好。

圖2 各組OPLS-DA得分散點圖（左）和置換檢驗圖（右）

2.3 兩組治療后差異代謝物變化 見表1，圖3。對治療后兩組患者VIP>1的代謝物保留并進行統計t檢驗，P<0.05的代謝物作為差異代謝物。利用KEGG、HM?DB、PubChem等相關數據庫進行檢索，對代謝物鑒定和代謝通路分析后找到37種差異代謝物，其中12種與本研究相關有重要貢獻，其中富馬酸、生育酚、D-谷氨酸3種在治療組中呈上升趨勢，其余羥基丙酮、葡萄糖、琥珀半醛、亞油酸甲酯、2-脫氧-D-半乳糖、4-羥基丁酸乙酰酯、二十酸、硬脂酸、木糖9種呈下降趨勢。

表1 兩組差異代謝物變化趨勢比較

圖3 兩組患者代謝物的熱圖

2.4 兩組血漿差異性代謝物的代謝通路分析 將鑒定的12個差異性代謝物導入KEGG http：//www.ge?nome.jp/kegg/和 Metabo Analyst http：//www.metaboana?lyst.ca/數據庫中構建中藥復方治療AECOPD痰濁壅肺證的相關代謝通路，總共發現15條代謝通路，主要相關的4條代謝通路，代謝通路分析的結果以氣泡圖所示（見圖4）。按影響值從大到小依次為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，丁酸鹽代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，淀粉與蔗糖代謝，其影響值分別為0.33、0.08、0.06、0.02。見表2。

3 討論

圖4 寬胸理肺湯聯合三子養親湯治療AECOPD痰濁壅肺證血清代謝通路富集分析

表2 代謝通路結果一覽表

目前普遍的認識為AECOPD不僅與氣道炎癥有關，還是一個全身系統性炎癥，筆者前期的研究已證明血液中某些炎癥因子水平顯著升高［6-7］。中醫學COPD歸屬“肺脹”范疇，古代眾多醫家認為COPD的發生多由久病肺虛，痰濁潴留，每因再感外邪誘使病情發作加重，病機以痰為根本。痰濁壅肺為最常見證型之一，臨床表現上，急性發作期患者咳、痰、喘及炎癥明顯加重，此階段痰涎較多。寬胸理肺湯由瓜蔞薤白半夏湯、三拗湯、二陳湯3方組成，已經證明臨床療效顯著［6-7］，現已進入國家中醫藥管理局診療規范指南選用方劑。筆者前期基于AECOPD痰濁壅肺證患者進行了大量中藥復方臨床療效和藥物作用機制方面的研究［2，6］，發現寬胸理肺湯聯合三子養親湯能更好改善AECOPD患者臨床癥狀，減輕血清炎癥反應。

本研究基于GC-TOFMS代謝組學技術來評價西醫規范治療基礎上使用寬胸理肺湯聯合三子養親湯后，與單西藥對照組比較，患者的代謝產物有何變化，以探討中藥復方的作用機制。結果篩選出12個差異代謝物（包括氨基酸、脂肪酸、糖），血清中上調代謝物比較有意義的是富馬酸、生育酚、D-谷氨酸3種；下調物質中比較有意義的是羥基丙酮、葡萄糖、琥珀半醛、亞油酸甲酯、2-脫氧-D-半乳糖、4-羥基丁酸乙酰酯、二十酸、硬脂酸、木糖。通路富集表明差異代謝物在體內主要涉及D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，丁酸鹽代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、淀粉與蔗糖代謝4條代謝途徑。

脂類代謝紊亂和炎癥有密切的關系，游離脂肪酸可以活化巨噬細胞，吞噬脂滴，形成泡沫細胞，釋放大量炎性因子，參與炎癥的發生和發展過程［8］。炎癥過程中，脂質分解使能源的主要來源增強，游離的脂肪酸含量增高。本試驗檢測出中西醫結合給藥后硬脂酸、二十酸、亞油酸甲酯等脂肪代謝產物較單純西藥組有回調趨勢，說明中藥可能是通過降低機體的脂肪氧化降解過程，減少炎癥因子的釋放，從而恢復AECOPD導致的機體脂肪酸代謝紊亂，達到抗炎作用的。

COPD患者在急性加重期引起急性炎癥反應，炎癥反應時趨化素增多，損害糖代謝過程［9］。血糖可能是影響AECOPD預后的一個新的預測因子，因血糖升高的可能原因有胰島素抵抗、治療時加用糖皮質激素、急性應激時升糖激素分泌增多等［10］。AECOPD患者如伴有高血糖狀態時，其血清炎性反應程度明顯升高，凝血功能紊亂加劇，肺功能損傷程度進一步加重［11］。亦有研究表明內毒素刺激后的小鼠較正常小鼠呈現高血糖和高血乳酸含量［12］。以上研究均證實高血糖與炎癥有密切的關系。本研究結果表明加入中藥治療后可以回調葡萄糖、半乳糖、木糖含量，使糖酵解恢復。葡萄糖減少亦可能是被大量優先氧化以提供能量，使脂肪分解減少，脂肪酸減少，最終氨基酸代謝開始逐漸恢復正常。

谷氨酸是蛋白質的主要構成成分，在生物機體起著重要的作用，D-谷氨酸是其衍生物。谷氨酸大部分由谷氨酸轉運體（GLT-1，GLAST）攝取，被谷氨酰胺合成酶（Gs）轉化為谷氨酰胺，谷氨酰胺再被轉運合成谷氨酸，參與谷氨酸-谷氨酰胺循環。谷氨酰胺是體內含量最多的條件必需氨基酸之一，作為免疫系統的主要能量來源，能促進蛋白合成，在改善COPD患者營養及免疫功能上具有顯著效果［13］。谷氨酰胺可促進常年腸道細胞ATP生成，是腸內能量生成的最大貢獻者，并能提高機體抗氧化能力，減少氧化應激反應［14］。近期發現谷氨酰胺可抑制COPD患者炎性細胞中p38MAPK通路的活化，并下調IL-8的表達，達到抗炎作用［15］。本研究中中藥干預后機體內D-谷氨酸增高，提示中藥具有調節能量代謝與抗炎作用。

在丁酸鹽代謝通路中4-羥基丁酸乙酰酯可轉化為琥珀半醛，琥珀半醛可在琥珀酸半醛脫氫酶作用下轉化為琥珀酸，后者是TCA循環的中間代謝產物，在線粒體生成ATP的過程中起關鍵作用。琥珀酸可以通過直接抑制PHD酶的活性，調節HIF-1α信號傳導，作為炎癥中的一種物質代謝信號，促進巨噬細胞中炎癥的發生［16］。琥珀酸在TCA循環中可被琥珀酸脫氫酶（SDH）轉化為富馬酸，中西醫結合組較西藥對照組治療后富馬酸量增多，說明中藥復方可能加強4-羥基丁酸乙酰酯轉化為富馬酸過程，增強SDH活性，導致琥珀酸含量消耗性減少，促進TCA循環產能，具有抑制炎癥反應和改善能量代謝作用。生育酚是維生素E的水解產物。維生素E、生育酚均具有強烈的抗氧化作用，具有保護血管內皮、減少氧化自由基對血管壁破壞的作用［17-18］。COPD患者氧化應激及其引起的炎癥反應程度較高，抗氧化治療成為目前治療的熱點［19］。血中維生素E水平偏低與急性呼吸道感染程度相關［20］。中西醫結合組較西藥組生育酚含量升高，說明中藥復方具有抗氧化應激及抗炎作用。

綜上所述，本研究采用GS-MS代謝組學技術對寬胸理肺湯聯合三子養親湯干預AECOPD痰濁壅肺證患者血清內源性代謝物的規律進行研究。代謝組學檢測結果提示，中藥復方聯合常規西藥治療后血漿代謝物與單純西藥治療后代謝物不同，中藥復方可能是通過影響能量代謝、糖代謝、脂肪代謝、氨基酸代謝及提高抗氧化、抗炎作用達到治療的作用。