扶正通絡解毒湯對急性心肌梗死大鼠心肌組織內游離鈣離子濃度、MMP-9、MDA及SOD的影響?

范才清 陳 姚 張 帆 蒲建璐

（四川大學華西醫院，四川 成都 610000）

急性心肌梗死（AMI）是患者冠狀動脈出現供血不足或中斷供血情況，導致心肌組織持續性處于缺血缺氧狀態進而引發心肌壞死性病變［1］。國內外研究表明，除心功能降低外，AMI患者在病理上還表現為心肌組織鈣穩態失調、心室重構和氧自由基生成。上述病理表現涉及多項觀察指標，如心肌游離鈣、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）［2-3］。研究上述指標的變化趨勢，對于揭示AMI發病機制、評估療效、為AMI治療提供新的方向具有積極意義。在中醫理論中，AMI屬于“卒心痛”范疇，心脈瘀阻、心氣內虛是本病的病因病機［4］。中藥方劑扶正通絡解毒湯由黃芪、丹參、水蛭、黃連、當歸等中藥材組成，具有通絡解毒、益氣活血的功效［5］，可針對AMI病因病機對癥治療，取得顯著療效，但目前尚缺少中藥治療AMI與西醫理論中心肌組織鈣穩態失調、心室重構和氧自由基生成調節關系的動物實驗和臨床研究［6］。本研究通過動物實驗的方式探討了扶正通絡解毒湯對AMI大鼠模型血清MMP-9、MDA、SOD活性及心肌組織內游離鈣離子濃度的影響及相關作用機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取60只健康的無特定病原體（SPF）級SD大鼠，均為雄性，體質量200～300 g，周齡10～12周，實驗前體檢身體健康、活動正常、心臟功能和心電圖譜正常，預計生存期大于6個月，由上海劍鈍生物科技有限公司提供，合格證號為SCXK（滬）：2019-0013。AMI大鼠模型構建、飼養和后續動物實驗均與上海劍鈍生物科技有限公司合作完成。造模前籠養大鼠7 d適應環境，飼養溫度（22±2）℃，濕度（60±10）%，飲用水為純凈水，飼料符合GB14924.3-2010標準，實驗周期4～6周，嚴格按國家實驗動物管理法規進行實驗。

1.2 實驗藥物 扶正通絡解毒湯（組成：黃芪、銀耳各30 g，丹參、生地黃、梔子、白芍各15 g，麥冬12 g，柴胡、紅花、川芎、當歸、連翹、檀香、金銀花各10 g，水蛭、黃連各6 g，甘草7 g。藥材由成都中醫藥大學醫技所大藥房提供，將上述藥材浸泡后用400 mL水煎煮沸，去渣取藥汁，繼續煎煮濃縮至原液質量濃度為2 g/mL）。鹽酸地爾硫片（合心爽，天津田邊制藥有限公司，國藥準字H12020126），0.9%氯化鈉溶液（青島日水生物，10801-1），克賽依諾肝素鈉注射液（NOFI WIN?THROP INDUSTRIE，規格0.6 mL∶6 000 A×aIU，2支）。

1.3 試劑與儀器 PBS緩沖液（上海鼓臣生物技術有限公司）、戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司）、大鼠血清MMP-9酶聯免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（上海美軒生物科技有限公司，MEXN-R0581）、SOD ELISA試劑盒（上海創祥生物）、MDA ELISA試劑盒（上海篤瑪生物科技有限公司）、組織鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒（杰美基因，GMS50097.2）；大鼠血清CK-MB ELISA檢測試劑盒（濰坊祺翔生物科技有限公司，MB-6930）、大鼠cTnI ELISA檢測試劑盒（江西江藍純生物試劑有限公司，JLC14924）。BLS-X2獸用彩超機（徐州貝爾斯電子科技有限公司），ST-960多功能酶標儀（科華），6/0可吸收縫線（博達），D-16C臺式小型冷凍離心機（賽多利斯），BS124S電子分析天平（賽多利斯），LS-20ECG動物心電圖記錄分析儀（北京拜安吉科技有限公司），HX-101E小型動物呼吸機（成都秦盟科技有限公司），UV754N紫外分光光度儀（青島路博）。

1.4 分組與造模 見表1。采用隨機數字表法將60只SD大鼠分為造模組與假手術組，每組30只。造模組采用改良冠脈結扎手術法制作AMI大鼠模型，術前以2.5 mL/kg腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，大鼠肌腱反射消失后實施手術，取仰臥位，注射肝素鈉，鼠頸前區除毛、備皮，分離右頸部外靜脈和氣管，連接呼吸機，潮氣量6 mL/kg，吸氣∶呼氣比為1∶2，呼吸頻率80次/min，胸前取備皮，連接心電監護裝置（心電圖），沿著鎖骨中線做縱切口，剝離皮膚，L4～L5肋間鈍性分離肌層，開胸，剪開心包，輕壓胸廓，暴露心臟，在肺動脈圓錐、左心耳間，距冠狀動脈起始2～3 mm處用6/0縫線結扎左冠狀動脈前降支，此時大鼠左室前壁變白、心跳減弱，將心臟還納胸腔，關胸、縫合切口，術后1～5 min內大鼠心電圖Ⅱ導聯ST段弓背向上抬高≥0.1 mV或病理性Q波作為手術成功的標志。假手術組僅開胸，不給予冠脈結扎，術后2 h抽取鼠尾靜脈血測定CK-MB活性、cTnI濃度，造模組大鼠血清CK-MB活性比值及cTnI水平較假手術組升高，差異有統計學意義（P<0.05），證明造模成功。

表1 兩組大鼠術后2 h血清CK-MB比值及cTnI水平比較（±s）

表1 兩組大鼠術后2 h血清CK-MB比值及cTnI水平比較（±s）

與假手術組比較，△P<0.05

組別造模組假手術組cTnI（μg/L）1.97±0.46△0.92±0.21 n 30 30 CK-MB2/CK-MB1 1.86±0.42△1.25±0.17

1.5 干預方法 采用隨機數表法將造模成功的30只AMI大鼠分為3組，各組10只，參照60 kg標準成人臨床用藥劑量，利用體表面積-劑量對應關系換算灌胃藥液劑量1 mL/100 g。中藥組予扶正通絡解毒湯：用0.9%氯化鈉溶液將扶正通絡解毒湯2 g/mL稀釋為1.4 g/mL，灌胃劑量為8 g/kg。西藥組予鹽酸地爾硫片溶液：將30 mg鹽酸地爾硫卓片研成粉末后，加0.9%氯化鈉溶液稀釋為0.75 g/L，灌胃劑量2.6 mg/kg。模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組均在成模24 h后通過灌胃給藥，每天給藥1次，連續給藥7 d，期間檢測和比較3組大鼠相關指標水平。

1.6 標本采集與檢測 1）血清MDA、MMP-9濃度和SOD活性：在給藥前后抽取鼠尾靜脈血約1 mL置于不含熱原和內毒素的試管中，3 000 r/min離心10 min取上清液在2 h內完成檢測，不能在2 h內完成檢測的血清樣本及試劑盒均應保存在4℃環境中。檢測時利用96孔板上樣，每組待測血清樣本做3個復孔，按照ELI?SA檢測試劑盒說明書要求操作，主要步驟為：預處理→上樣（標準品、待測品稀釋液，平行樣本）→加帶有辣根過氧化物酶（HRP）標記的一抗→封孔，37℃孵育60 min→洗板（PBS緩沖液洗滌5次）→加二抗，封板，37℃避光孵育15 min→加顯色液、終止液→利用酶標儀測定各孔OD值。檢測方法為雙抗夾心法，利用酶標儀測定血清MDA、MMP-9和SOD吸光度，檢測波長450 nm，并利用標準曲線換算成濃度值和單位酶活值。2）比色法測定梗死區心肌游離鈣離子濃度：給藥第7日，在抽血完成后處死各組大鼠，通過手術取出大鼠心臟組織，在顯微鏡引導下將梗死區心肌剪成小塊，稱質量后用PBS溶液清洗，利用液氮冷凍并碾成粉末，加入裂解液后孵育30 min制成心肌細胞液，16 000 r/min離心5 min，取上清，按照檢測試劑盒說明書要求，利用比色法測定心肌游離鈣離子濃度，分光光度儀的檢測波長為570 nm。

1.7 統計學處理 應用SPSS23.0統計軟件。對研究資料之間進行對比分析，計量資料表示為（）形式，組間兩兩配對比較采用t檢驗；計數資料（%）組間兩兩比較采取χ2檢驗；組內資料兩兩比較采取單因素方差分析，3組及以上資料比較則采取Z檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清MMP-9、MDA和SOD水平比較見表2。給藥7 d后，與給藥前相比，3組AMI大鼠的血清MMP-9、MDA濃度和SOD活性改善水平差異有統計學意義（P<0.05）。MMP-9、MDA濃度：中藥組<西藥組<模型組；SOD活性：中藥組>西藥組>模型組。

表2 各組大鼠干預前后血清MMP-9、MDA濃度及SOD活性比較（±s）

表2 各組大鼠干預前后血清MMP-9、MDA濃度及SOD活性比較（±s）

與本組干預前比較，?P<0.05；與中藥組同時期比較，△P<0.05；與西藥組同時期比較，▲P<0.05

組別中藥組（n=10）西藥組（n=10）模型組（n=10）時間干預前干預后干預前干預后干預前干預后MMP-9（nmol/L）465.42±48.17 276.54±24.82*464.98±49.06 382.45±30.95*△465.89±50.47 459.46±48.74*▲MDA（nmol/mg）3.05±0.41 1.24±0.21*3.02±0.35 2.05±0.19*△3.04±0.43 2.97±0.41*▲SOD（nU/mg）5.12±0.95 20.72±2.14*5.14±1.03 13.25±2.95*△5.09±0.91 5.02±1.05*▲

2.2 各組大鼠梗死區心肌組織內游離鈣離子濃度比較 見表3。給藥第7日，3組大鼠梗死區心肌組織內游離鈣離子濃度比較，差異有統計學意義（P<0.05）：中藥組<西藥組<模型組。

表3 各組大鼠梗死區心肌組織內游離鈣離子濃度比較（nmol/L，±s）

表3 各組大鼠梗死區心肌組織內游離鈣離子濃度比較（nmol/L，±s）

與中藥組比較，?P<0.05；與西藥組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

組別中藥組西藥組模型組n 10 10 10梗死區心肌組織內游離鈣離子濃度159.62±9.74#△208.18±8.43*△321.82±15.19*#

3 討論

AMI是一種發病率、致死率和致殘率較高的心腦血管疾病。AMI病因的十分復雜，一般認為，冠動脈供血供氧不足是誘發AMI的主因［7］，而國內外近年來的研究則指出，AMI的發生和進展還很有可能與下述原因有關。1）心肌細胞游離Ca2+負責調節心肌舒縮功能，其濃度水平也與心肌細胞興奮程度呈正相關，而AMI發生后患者心肌游離Ca2+出現超載，患者心臟收縮和舒張出現障礙，引發心力衰竭［8-9］。2）心肌組織持續性缺血缺氧會引發心室重構，心肌組織通過分泌MMPs來降解心肌膠原蛋白和基底膜，重塑心臟適應性。而研究也提示，此時患者血清中MMP-9的濃度較正常水平顯著升高［10-11］。（3）AMI發生后，患者大腦中氧自由基的產生明顯加快，此時SOD會因清除過多氧自由基而消耗，并產生大量生物毒性脂質過氧化物MDA，從而損傷患者腦細胞和神經細胞，引發腦梗死等不良反應［12］。西醫針對AMI成因和進展趨勢，采用鈣離子阻滯劑如硫氮酮等藥物治療，以抑制心肌鈣離子內流、擴張冠狀動脈血管、松弛心血管平滑肌［13］，臨床研究結果顯示，應用硫氮酮治療AMI的有效率為60%～70%，對于室上性心動過速的療效優秀，高達88%～94%，對于心血管血氧供應改善十分顯著［14］。不過硫氮酮對于抗氧化指標和心室重構的影響少有文獻提及，也具有較多的不良反應和禁忌證，因此應探尋一種更為安全有效的AMI治療方案，以便獲得更理想的療效和預后［15］。

近年來，臨床越來越重視將中醫辨證論治或中西醫結合治療心血管疾病。中醫理論將AMI歸為“胸痹”“卒心痛”范疇，認為AMI的病機分為稟賦不足、瘀血阻心、痰瘀閉心、情志致郁、寒邪凝滯等。AMI患者的共同病證為心絡不通，雖原因各異，但均應活血散結、解毒通絡。中醫認為濁毒是炎癥因子、氧自由基，而鈣調紊亂、心室結構改變則是“阻絡”表現［16］。扶正解毒通絡湯方中含有丹參、黃芪、黃連、梔子、麥冬、水蛭等中藥材，從組方配伍上分析，丹參歸心、肝經，可活血祛瘀，通經止痛；黃芪可補益正氣；丹參、黃芪二者為君藥，主治胸痹心痛。水蛭可破血通經、黃連可清熱解毒，水蛭、黃連為臣藥，主治心經實熱。麥冬可潤肺清心、瀉熱生津；柴胡可和解表里，疏肝解郁，升陽舉陷；白芍可養血調經止痛，麥冬、白芍和柴胡均為佐藥，主治熱病心煩、胸脅脹痛。連翹、甘草為使，可清熱、解毒、散結、消腫、調和諸藥，主治心氣虛，心悸怔忡。基于動物實驗的現代藥理學也表明，扶正通絡解毒湯中的丹參酮ⅡA可顯著縮小心肌梗死范圍，復方丹參注射液則具有抗心肌缺血、減少心肌細胞膜的脂質過氧化反應、抑制Ca2+內流的功效；黃芪則富含多糖、皂苷類、黃酮類和氨基酸化學物質，黃芪總皂苷具有抗氧化、清除氧自由基等藥理作用，黃芪甲苷則具有舒張血管平滑肌、緩解肌漿網、保護腦細胞等藥理作用，可有效預防心室重構、保護心肌組織；其余中藥材則具有免疫調節、降血糖、降血壓、抗疲勞、抗炎等藥理作用［17］，這些都是扶正解毒通絡湯治療AMI的理論基礎。

至今為止，雖有文獻對心肌細胞游離Ca2+、MMP-2、MMP-9和心肌抗氧化指標水平與AMI療效和預后的關系進行了研究，證實上述實驗室指標檢測結果與AMI患者的療效評估、轉歸預后具有關聯性，但仍缺少將中藥療效與心肌細胞游離Ca2+、MMP-2、MMP-9和心肌抗氧化指標聯系起來的研究［18］。本研究結果顯示，給藥后3組AMI模型大鼠的血清MMP-9、MDA濃度、SOD活性及梗死區心肌組織內游離鈣離子濃度比較差異有統計學意義（P<0.05）。結果表明扶正通絡解毒湯可促進AMI模型大鼠的MMP-9、MDA濃度和SOD單位活性水平的改善，也能降低缺血心肌組織內游離鈣離子濃度水平。這一結果值得進一步研究。