利用基因組編輯技術構建擬南芥雙突變體iqm5-1 flc

李惠梅 范甜 呂天曉 周玉萍 田長恩

摘 要

本研究組前期發現，擬南芥IQM5基因突變引起開花推遲，可能是提升了開花抑制因子FLC的轉錄本水平所致。然而 ，缺乏遺傳學證據。本實驗利用基因組編輯技術構建FLC的編輯載體，轉化IQM5基因的T-DNA插入突變體iqm5-1，通過抗生素抗性篩選和測序得到雙突變體iqm5-1 flc，為確定IQM5通過FLC調控開花提供了遺傳材料。

關鍵詞

IQM5;FLC;基因組編輯;雙突變體;擬南芥

中圖分類號： Q943.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457 . 2020 . 14 . 67

擬南芥的IQM家族共有6個成員， N-端有一段序列與豌豆重金屬誘導蛋白同源， C-端則有一段與核糖體失活蛋白天花粉素同源的序列。IQM家族各成員可能在不同環境條件和不同發育階段所起作用各不相同[1-2]。本研究組發現在幼苗、莖、蓮座葉、花序葉和花蕾中，均存在 IQM5.1 和 IQM5.2 的兩種轉錄本，不過，不同組織器官中二者的比例不盡相同[3]。在擬南芥中，已探明春化、光周期、赤霉素、年齡途經、自主以及溫度等6條調控開花時間的遺傳途徑。開花抑制因子FLC能直接抑制包括FT、SOC1和FD在內的開花整合基因的表達[4]。本研究組發現，IQM5的T-DNA插入突變體iqm5-1和iqm5-2在長日照或短日照下均呈現晚花表型;FLC在野生型植株的莖、葉中均微弱表達，但在突變體iqm5-1和iqm5-2的莖、葉中表達量均顯著增高[5]。因此，推斷IQM5基因突變引起開花推遲，可能是提升了開花抑制因子FLC的轉錄本水平所致[5]。本研究旨在利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術構建雙突變體iqm5-1 flc，為確定IQM5通過FLC調控開花提供遺傳材料。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

植物材料：iqm5-1（CSHL_GT18219）是Landsberg erecta（Ler）生態型的IQM5 T-DNA 插入突變體，來源于Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， USA。載體：pYLsgRNA-AtU3d、pYLsgRNA-AtU3b、pYLCRISPR/ Cas9-Pubi-H菌種由華南農業大學劉耀光院士友好贈送。菌種：大腸桿菌E.coli DH5α及農桿菌GV3101菌株均由本實驗室保藏。試劑：Bsa I核酸內切酶購于NEB公司，其他試劑盒與工具酶均購自TAKARA生物工程有限公司;MS鹽（Murashige&Skoog ）購自Sigma公司;潮霉素、Yeast Extract、Typtone和Agar M等為生工生物工程（上海）有限公司產品 。測序及引物合成：由生工生物工程（上海）有限公司及完成。引物序列 （均為5′→3′）：SP-L1：GCGGTGTCATCTATGTTACTAG，SP-R：CGACATAGATGCAATAACTTCG;3D-FLC-F：GTCACCTTCTCCAAACGTCGCAA，3D-FLC-R：AAACTTGCGACGTTTGGAGAAGG;3B-FLC-F：GTCAGGAGAAGCTGTAGAGCTTGC，3B-FLC-R：AAACGCAAGCTCTACAGCTTCTCC;Cas9-FLC-F：GCGGTACACGTGGCAATCTT，Cas9-FLC-R：ACAACATCGAGCACGCATCA。

1.2 實驗方法

質粒提取、PCR、酶切、DNA片段回收與純化方法參照對應試劑盒說明書進行。載體構建參考CRISPR/Cas9基因編輯技術方法[6]進行：在FLC基因中設計2對靶點接頭3D-FLC-F/R和3B-FLC-F/R，分別退火連成小片段，重組插入經BsaI線性化的載體pYLsgRNA-AtU3d和pYLsgRNA-AtU3b中;經gRNA表達盒擴增后重組入經BsaI線性化的雙元載體pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H;熱激轉化大腸桿菌，經菌落PCR鑒定及測序驗證后提取質粒轉化農桿菌，再利用農桿菌蘸花法轉化突變體iqm5-1;收獲成熟種子，經潮霉素抗性篩選得到T0代幼苗，移至土壤培養;在靶點上下游設計引物Cas9-FLC-F/R進行PCR擴增和測序，篩選基因編輯成功株系，在后代中繼續篩選純合轉化植株。

2 結果與分析

本研究利用CRISPR/Cas9對擬南芥iqm5-1的FLC基因進行編輯。首先，分別將靶點接頭3D-FLC-F/R和3B-FLC-F/R退火連成小片段，插入pYLsgRNA-AtU3d-FLC和pYLsgRNA-AtU3b-FLC，經gRNA表達盒擴增，得到預期產物（圖1-A）。其次，將擴增產物插入線性化的pYLCRISPR/Cas9-Pubi-H后轉化大腸桿菌，挑選抗性菌落進行PCR鑒定，獲得陽性菌落（圖1-B）;進一步，從陽性菌落提取質粒，轉化農桿菌，菌落PCR鑒定結果符合預期（圖1-C）;最后，利用農桿菌轉化擬南芥突變體iqm5-1，收獲種子經潮霉素抗性篩選獲得候選植株，對其進行PCR鑒定獲得預期產物（圖1-D），外送測序獲得預期的基因組編輯植株。

將上述候選編輯植株后代繼續進行抗性篩選和序列分析，成功獲得1株純合雙突變體iqm5-1 flc。在該雙突變體中，iqm5-1 已經報道[5];flc的突變如圖2所示：從FLC起始密碼子ATG的A開始，在第74與第75位堿基間插入1個堿基（T），該堿基的插入導致其后序列發生移碼突變，并提前終止，產生僅有39個氨基酸殘基的突變蛋白，而野生型FLC有196個氨基酸殘基。

3 討論

本研究組前期發現，IQM5 的2個T-DNA插入突變體iqm5-1和iqm5-2在長日照或短日照條件下均呈現晚花表型，且其莖、葉中FLC的表達量均顯著增高。因此，IQM5基因突變可能通過提升開花抑制因子FLC的轉錄本水平而實現[5]。不過，缺乏遺傳材料。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術方法，成功編輯了突變體iqm5-1中的FLC基因，篩選得到雙突變體iqm5-1 flc，為確定IQM5通過FLC調控開花提供了遺傳材料。

參考文獻

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[2] ZhouYP， Chen YZ， Yamamoto KT， Duan J， Tian CE. Sequence and expression analysis of the Arabidopsis IQM family[J]. Acta Physiol Plant， 2010，32： 191–198.

[3] 弓路平， 蕭文慧， 周玉萍，黃小玲，田長恩. 擬南芥 IQM5.2 的克隆、表達及生物信息學分析[J].生物技術通報，2016，32（5）：69-74.

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[6] Ma XL， Liu YG. CRISPR/Cas9-based multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Curr ?Protoc Mol ?Biol ， 2016， 115：31.6.1-31.6.21.