熒光PCR探針熔解曲線法檢測珠海市孕婦MTHFR和MTRR基因多態(tài)性研究

李戀湘，肖奇志，王格，周玉球，李磊，胡玲玲

(珠海市婦幼保健院，珠海市醫(yī)學(xué)遺傳研究所，廣東 珠海 519001)

葉酸又稱蝶酰谷氨酸，是維生素B復(fù)合體之一，是人體尤其是孕婦必需的營養(yǎng)物質(zhì)。人體內(nèi)葉酸代謝有兩個限速酶，即亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)和蛋氨酸合成酶還原酶(MTRR)。MTHFR將5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-MTHF)轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸(5-MTHF)，為體內(nèi)合成代謝提供了甲基；MTRR將5-MTHF進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為四氫葉酸(THF)，且將同型半胱氨酸(Hcy)轉(zhuǎn)化成蛋氨酸(Met)。故當(dāng)編碼這兩個酶的基因發(fā)生突變時，相應(yīng)酶活性就會降低，不能為體內(nèi)合成代謝提供足夠的5-MTHF，引起DNA、蛋白質(zhì)的合成與修飾反應(yīng)異常，染色體不穩(wěn)定，體內(nèi)Hcy蓄積，從而導(dǎo)致孕婦胚胎停止發(fā)育、習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎，胎兒出現(xiàn)神經(jīng)管缺陷、先心病、唇腭裂等畸形或智障兒等不良孕產(chǎn)結(jié)局[1-2]。由于MTHFR和MTRR基因多態(tài)性直接影響葉酸代謝相關(guān)酶的活性，導(dǎo)致葉酸代謝障礙，檢測MTHFR和MTRR基因多態(tài)性可了解孕婦對葉酸的利用能力。目前，檢測MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的方法很多，DNA測序仍為金標(biāo)準(zhǔn)，但因費時價貴、分析通量小、設(shè)備及人員要求高等弊端，難以在臨床醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用。而熒光PCR探針熔解曲線分析(PMCA)技術(shù)則是一種用于已知基因突變檢測的技術(shù)，具有分析通量大、準(zhǔn)確快速和無需開蓋操作等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于常見遺傳病(如地中海貧血和蠶豆病)基因診斷和產(chǎn)前診斷中[3-4]，市場應(yīng)用潛力巨大。本文應(yīng)用該技術(shù)檢測MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性并對孕婦群體葉酸利用能力進(jìn)行了遺傳風(fēng)險評估，分析了其與血清Hcy的相關(guān)性。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2016年4月到珠海市婦幼保健院進(jìn)行產(chǎn)前保健的400 例孕婦，年齡18～43 歲，孕周為7～38+2周。

1.2 標(biāo)本采集

空腹8～12 h后采集靜脈血樣2支，每支2 mL，其中1支EDTA-K2抗凝管用于DNA分析，另1支干管收集的標(biāo)本待分離后用于檢測Hcy水平。測試前均與孕婦簽署了知情同意書。

1.3 試劑與儀器

全自動核酸提取儀(廈門致善Lab-Aid824)；熒光PCR儀(上海宏石SLAN-96S)和全自動生化分析儀(日立7180)。DNA抽提、MTHFR C677T及MTHFR A1298C和 MTRR A66G基因多態(tài)性熒光PCR探針熔解曲線試劑盒和血清Hcy檢測試劑盒分別由廈門致善生物科技有限公司[醫(yī)療器械注冊證號為：閩廈食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第1400001號]和廣州科方生物技術(shù)有限公司[醫(yī)療器械注冊證號為：粵食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第2400353號]提供。

1.4 方法

1.4.1 DNA抽提和質(zhì)量鑒定

1.4.2 基因多態(tài)性檢測

嚴(yán)格按照MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性熒光PCR探針熔解曲線檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作和結(jié)果判斷。簡要過程如下：將適合的待測DNA樣本25 μL直接加到含PCR各種成分的0.2 mL擴(kuò)增反應(yīng)管中，短暫離心后轉(zhuǎn)至熒光PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析。PCR循環(huán)參數(shù)為：預(yù)先50 ℃ 2 min去除擴(kuò)增產(chǎn)物污染后[尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)處理]，95 ℃預(yù)變性10 min后，接著進(jìn)行兩次PCR循環(huán)。第一次和第二次PCR循環(huán)參數(shù)分別為：95 ℃ 15 s→65 ℃ 15 s(每個循環(huán)下降1 ℃)→76 ℃ 20 s(10 cycles)和95 ℃ 1 min→55 ℃ 15 s→76 ℃ 20 s(50 cycles)。擴(kuò)增完畢后，即進(jìn)行熔解曲線分析。首先95 ℃變性1 min，45 ℃退火3 min，然后以0.4 ℃/s的速度從45 ℃升溫至85 ℃，同時采集熒光5-羧基熒光素(FAM)、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯熒光素琥珀酰亞胺酯(HEX)、5-羧基-X-羅丹明琥珀酰亞胺酯(ROX)通道信號，從而可得到PCR產(chǎn)物熔解曲線。通過雙盲方式用DNA測序方法對受試個體的上述基因多態(tài)性進(jìn)行分析以驗證該法的準(zhǔn)確度。DNA測序由廈門致善生物科技有限公司完成。

1.4.3 血清Hcy檢測

每批標(biāo)本均在室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評符合要求的前提下，采用酶循環(huán)法檢測血清Hcy水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PMCA法的結(jié)果驗證

通過雙盲方式，分別采用PMCA和DNA測序技術(shù)檢測了400份孕婦MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因的多態(tài)性，兩者的結(jié)果完全吻合(有代表性的結(jié)果分別見圖1和圖2)。

a b c

a b c

2.2 基因的多態(tài)性和Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

PMCA檢測400 例珠海市孕婦MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因多態(tài)性，其結(jié)果見表1。將MTHFR C677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G基因分型經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，χ2值分別為1.315，0.163和1.501，P值分別為0.251，0.686和0.220，均大于0.05，說明所檢孕婦具有區(qū)域代表性。MTHFR C677T位點TT，MTHFR A1298C位點CC，MTRR A66G位點GG純合子頻率分別為12.5%，1.7%和6.8%，MTRR A66G位點AG雜合子頻率為34.0%。

表1 珠海市孕婦常見葉酸代謝基因多態(tài)性分布及頻率

2.3 珠海市孕婦葉酸利用能力及血清Hcy水平

參照有關(guān)文獻(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，根據(jù)孕婦MTHFRC677T，MTHFR A1298C和MTRR A66G多態(tài)性檢測結(jié)果，將孕婦個體葉酸利用能力遺傳風(fēng)險依次從低到高分為未發(fā)現(xiàn)、低度、中度及高度風(fēng)險四個等級，本組分別為181 例(45.25%)，21 例(5.25%)，141 例(35.25%)和57 例(14.25%)。各等級遺傳風(fēng)險孕婦血清Hcy水平分別為(6.54±1.41)μmol/L，(6.80±1.23)μmol/L，(6.76±1.55)μmol/L和(7.71±1.94)μmol/L。Hcy水平升高(>11 μmol/L)者9 例，其中包括5 例高度、3 例中度和1 例未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險。高度風(fēng)險組與未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險組血清Hcy水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.958，P<0.05)，中度風(fēng)險組、低度風(fēng)險組血清Hcy水平與未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.310和-0.826，P>0.05)。

3 討 論

在備孕和孕期添加葉酸有助于預(yù)防圍產(chǎn)兒出生缺陷。有報道[2]編碼葉酸代謝2個限速酶MTHFR和MTRR基因多態(tài)性-MTHFR C677T位點TT純合型及A1298C位點CC純合型、MTRR A66G位點GG純合型及AG雜合型均與不良孕產(chǎn)史密切相關(guān)。珠海市孕婦MTHFR C677T位點TT純合型基因頻率(12.5%)與廣東省內(nèi)深圳地區(qū)孕婦[5]、惠州漢族女性比較[6]差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.910和0.489，P>0.05)，MTHFR A1298C位點CC純合型基因頻率(1.7%)與兩地比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.846和13.723，P<0.05)，而MTRR A66G位點AG雜合型及GG純合型基因頻率(40.8%)與深圳地區(qū)孕婦[5]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.787，P<0.05)，但與惠州漢族女性[6]比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.672，P>0.05)。本市與廣東周邊城市比較仍有其自身的分布特點。孕婦人群中葉酸利用能力遺傳高風(fēng)險的個體比未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險的個體發(fā)生不良孕產(chǎn)的風(fēng)險高2.61倍[7]，而且在孕期中長期高Hcy水平也直接影響宮內(nèi)胎兒生長發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致早產(chǎn)、低體重兒等出生[1-2]。本研究也發(fā)現(xiàn)孕婦葉酸利用能力遺傳高風(fēng)險人群的血清Hcy水平明顯高于未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險人群(P<0.05)，同時也發(fā)現(xiàn)中低風(fēng)險人群與未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險人群的血清Hcy水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，造成這種結(jié)果的主要原因是目前普遍提倡在備孕和孕期就補(bǔ)充足量的葉酸或富含葉酸的食物，從而使孕婦血清Hcy水平大多表現(xiàn)為正常或升高不明顯[8]。另外，MTRR基因多態(tài)性還可修正MTHFR C677T位點TT純合型對葉酸代謝的影響[9]。盡管如此，在不同遺傳風(fēng)險組都能檢出血清Hcy水平明顯升高(高度、中度和未發(fā)現(xiàn)風(fēng)險組分別為5 例、3 例、1 例)，所以，除了根據(jù)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測結(jié)果給予個性化補(bǔ)充足量的葉酸外[10]，還可結(jié)合血清Hcy水平，采取有針對性的措施嚴(yán)密監(jiān)測胎兒的生長發(fā)育情況，以預(yù)防出生缺陷的發(fā)生。

目前臨床上檢測MTHFR和MTRR基因多態(tài)性大多采用DNA測序、限制性片段長度多態(tài)性、Taqman-MGB以及質(zhì)譜等方法[1-2]，但大多操作繁瑣、昂貴費時、分析通量小或設(shè)備要求高，不適宜于大規(guī)模推廣。PMCA技術(shù)是熒光PCR結(jié)合探針熔解曲線分析技術(shù)，PCR擴(kuò)增后通過檢測PCR產(chǎn)物多色熒光熔解曲線就可快速檢出一個或多個堿基的雜合或純合突變[3]，且檢測的DNA模板濃度范圍大(0.1～100 ng/μL)，而檢測時間僅需2.5 h，全程閉管操作，可防PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。由于熔解曲線熔點溫度值是由PCR儀自帶分析軟件自動給出，結(jié)果判斷直觀。作者通過雙盲方式，同時采用PMCA和DNA測序技術(shù)檢測了400 例珠海孕婦MTHFR和MTRR基因3個位點的多態(tài)性，結(jié)果兩者完全吻合，說明該技術(shù)準(zhǔn)確可靠。PMCA方法操作簡單、準(zhǔn)確靈敏、快速經(jīng)濟(jì)、檢測通量高且針對性強(qiáng)，非常適合于大規(guī)模用于臨床一線孕婦MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的檢測。

MTHFR和MTRR基因多態(tài)性與葉酸代謝的關(guān)系引起了臨床的高度關(guān)注，并正成為備孕和孕期精確補(bǔ)充葉酸的靶點。PMCA方法是一項適合于臨床一線檢測MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的實用技術(shù)。而MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測對于臨床評估孕婦葉酸利用能力的遺傳風(fēng)險，指導(dǎo)高危孕婦個性化補(bǔ)充葉酸和防止不良孕產(chǎn)結(jié)局有著重要的臨床實用價值。但PMCA技術(shù)也有自身的不足，如只能檢測到探針覆蓋區(qū)域的序列變異，對設(shè)備及DNA的要求高，且還可能存在引物非特異性擴(kuò)增、要求PCR產(chǎn)物片段在一定長度范圍內(nèi)等[11]。它雖可同時檢測到未知基因多態(tài)性位點，但需采用DNA測序或其他方法做進(jìn)一步的驗證。另外，MTHFR和MTRR基因多態(tài)性檢測若用于產(chǎn)前診斷，需提前了解胎兒營養(yǎng)狀況，還有待臨床進(jìn)一步研究。