UBE2C在宮頸癌中的表達及臨床意義

李樹瑋 趙暘 王華△

(1.湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院婦產科，湖北 襄陽 441100；2.錦州醫科大學湖北醫藥學院襄陽市第一人民醫院研究生培養基地，湖北 襄陽 441100)

宮頸癌是發病率最高的女性生殖系統惡性腫瘤，全球平均每年有53萬新發宮頸癌病例，宮頸癌總體死亡率達50%，其中發展中國家的宮頸癌死亡率超過85%[1]。因此，尋找宮頸癌的驅動基因、預后標志物及可能的治療靶點是額待解決的重要工作。本課題中我們首先查詢oncomine數據庫，發現泛素結合酶(ubiquitin-conjugatingenzyme,UBE2C)在宮頸癌組織中的表達水平均遠高于正常組織。接下來我們通過復習宮頸癌患者臨床和病理資料，應用免疫組織化學技術檢測UBE2C的在宮頸癌組織中的表達情況，探討UBE2C的表達在宮頸癌中的表達及臨床意義，旨在尋找宮頸癌發生發展的驅動基因、預后標志物和潛在的治療靶點。

1 材料與方法

1.1通過 Oncomine 數據庫(https://www.oncomine.org)篩選出宮頸癌與慢性宮頸炎組織的基因表達譜數據，然后進行整合分析，篩選出表達差異最顯著的基因進行后續分析。

1.2組織標本及相關資料 收集隨訪資料完整的2010年6月至2018年12月在湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院婦科接受宮頸癌根治術、經病理學證實的原發性CSCC患者石蠟包埋的腫瘤組織標本共109例，患者年齡<45歲者57例、≥45歲者52例；分化程度：高分化66例、低分化43例；病理類型：鱗癌89例、腺癌/腺鱗癌20例；腫瘤直徑：≥4 cm 57例、<4 cm 52例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅰb期64例、Ⅱa期45例；淋巴結轉移：陽性48例、陰性61例；宮頸浸潤：<1/2者39例、≥1/2者70例。所有患者術前無化療、放療或其他治療史，臨床分期參照2009年國際婦產科聯盟FIGO標準，另外收集正常宮頸鱗狀上皮組織標本(因子宮肌瘤行全子宮切除術)117例作為對照研究。所有患者的臨床資料完整，病理資料由病理科專業主任醫師復習，經醫院倫理委員會批準。

1.3主要試劑 鼠抗人UBE2C單克隆抗體(美國abcam公司，工作濃度為1∶500)，免疫組織化學檢測試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。

1.4免疫組織化學染色 標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。染色前使用二甲苯常規脫蠟，然后梯度酒精脫水，抗原微波熱修復， 3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶， UBE2C(1∶500)一抗4 ℃過夜，聚合酶輔助劑室溫 孵育20 min，辣根酶標記的二抗室溫孵育30 min， 二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，封片。

1.5結果判斷 免疫組織化學染色結果的判定：臨床和病理雙盲閱片。UBE2C主要在細胞核表達，陽性染色呈黃色或棕黃色。綜合染色強度和陽性細胞百分率計算染色積分。染色強度：不著色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。陽性細胞百分率：0%，0分；1%～25%，1分；26%～50%，2分； 51%～75%，3分；76%～100%，4分。兩項相加分值即為每個視野的染色積分(0～7分)，染色積分0分(-)、1～3分(+)、4～5分(++)和6～7分(+++)，高倍鏡下隨機取5個不同視野求平均染色積分。染色積分>3分為高表達(+)，≤3分為低表達(-)。晾干的切片可以在顯微鏡下觀察或者采集圖像。

1.6隨訪 隨訪自手術當日起開始計算生存時間， 通過門診電話及信訪等方式進行隨訪，從確診之日起進行隨訪，生存期以年為計算單位，隨訪時間為1～12年，中位隨訪時間為6年，最后一次隨訪時間2018年8月31日或失訪作為隨訪結束點。

1.7統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行數據分析，行χ2檢驗或t檢驗，應用Kaplan-Merier法建立以UBE2C表達為基礎的宮頸癌的生存曲線，采用Log-rank檢驗比較生存曲線間的差異；P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1Oncomine數據庫分析結果 結果顯示，UBE2C在宮頸癌組織中的表達水平均遠高于正常組織。見圖1。

2.2UBE2C在宮頸癌組織及慢性宮頸炎組織中的表達 UBE2C主要表達于宮頸鱗癌細胞胞核，細胞質中少有表達，陽性染色呈棕黃色至棕褐色顆粒狀(圖2)。UBE2C在慢性宮頸炎組織中(子宮肌瘤行子宮全切后宮頸組織)陽性表達率為20.51% (24/117)，在宮頸鱗癌組中的陽性表達率為77.1%(84/109)，差異具有統計學意義(χ2=72.33，P<0.01)。見圖2。

2.3UBE2C的表達與宮頸癌臨床病理因素之間的關系 以UBE2C低表達為對照組，發現UBE2C高表達與宮頸浸潤深度(χ2=30.027，P<0.01)、盆腔淋巴結狀態(χ2=11.472，P<0.01)、病理類型(χ2=4.786，P<0.05)、5年總生存率(P<0.01)和5年無進展生存率 (P<0.01) 密切相關，而UBE2C高表達與分化程度以及陰道切緣之間的關系無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 UBE2C陽性表達與臨床病理因素的關系

2.4UBE2C 表達水平與宮頸癌診斷及預后的關系 UBE2C診斷宮頸癌的ROC曲線如圖 3 所示，AUC 為0.719 (95%CI：0.506～0.733，P=0.039)，生存分析結果顯示，UBE2C 基因高表達組患者的生存期明顯低于低表達組(P<0.05)(圖 4)。

3 討 論

宮頸癌是危及女性健康第二常見的惡性腫瘤。以手術、放療、化療相結合的三位一體的綜合治療大大提高了患者的生存率，但每年仍舊有23.3萬人死于宮頸癌，超過100萬的人面臨手術、放化療帶來的困擾及死亡的威脅[2]。

隨著轉化醫學和精準醫學的發展，將生物醫學基礎研究與臨床結合的更為精密[3-4]。因此，本研究擬采用Oncomine 數據庫發現UBE2C在宮頸癌組織中的表達水平均遠高于正常組織。人泛素偶聯酶UBE2C 屬于泛素偶聯酶家族成員之一[5-6]，通過對細胞膜、細胞質到細胞核以及內質網腔等處的蛋白質進行泛素化酶和蛋白酶體的調控而發揮作用[7-8]。UBE2C過表達可導致細胞內重要功能蛋白質的降解失常，使細胞染色體組的不穩定性增加，提示UBE2C可能是腫瘤發生的觸發因子[9-10]。

研究[11]證實，UBE2C 基因在大多數正常組織中幾乎很難檢測到。通過基因表達譜交互分析(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)數據庫查詢 UBE2C基因，結果顯示在所有人體正常組織中均較少表達[12]；相反，UBE2C 基因在多種癌癥中高表達，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌等[13-16]。

本研究用免疫組化的方法從臨床標本中回顧性研究發現UBE2C在正常宮頸鱗狀上皮組織中表達明顯低于宮頸鱗癌中表達率(P<0.001)。本研究還發現UBE2C高表達與宮頸浸潤深度、盆腔淋巴結狀態、5年總生存率和5年無進展生存率密切相關；而UBE2C高表達與分化程度以及陰道切緣之間的關系無統計學意義，UBE2C診斷宮頸癌的ROC曲線AUC 為0.719，這提示我們可以用UBE2C診斷宮頸癌，從而提高檢測的靈敏度和精確度，為宮頸癌預防提供新的策略，也為宮頸癌的治療以及后期效果的評估提供新的依據。但是UBE2C 基因如何調控宮頸癌的發生發展尚待進一步開展相關機制研究進行闡述。