黃芪、冬蟲夏草對新生鼠腎積水梗阻解除后患腎IGF-1、TGF-β1表達的影響

吳謀東 馬洪 趙鵬 劉紅 楊遠貴 董淑荃 林金鳳

(1.遵義醫科大學附屬醫院小兒外科，貴州 遵義，563003；2.貴州省人民醫院，貴州 貴陽，550002)

先天性腎積水是小兒泌尿常見的結構畸形之一，最常見病因是腎盂輸尿管連接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction，UPJO)[1]。UPJO 引起尿液流出受阻，腎盂腎盞擴張、積水，腎實質受壓缺血，從而導致腎功能受到損害。對中、重度先天性腎積水多需手術干預，而術后如何促進患腎功能有效恢復，一直是困擾小兒泌尿外科醫生的難題。黃芪、冬蟲夏草在臨床上對高血壓腎病、糖尿病腎病以及腎小球腎炎等慢性腎病的腎損害有保護作用，但是否有助于促進患腎功能的有效恢復還未見研究報道。為此，本研究建立先天性腎積水手術解除梗阻動物模型，應用黃芪、冬蟲夏草進行干預，選取與腎間質纖維化密切相關，參與慢性腎臟疾病發生、發展過程的細胞因子IGF-1、TGF-β1為檢測指標，測定其在患腎組織中的表達情況，以探討黃芪、冬蟲夏草在先天性腎積水梗阻解除后，能否有效促進患腎功能的康復，以期為臨床更好地治療該類疾病提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1分組及模型制作 SPF級成年Wistar雌鼠20只(250±40)g，雄鼠5只(300±40)g，由第三軍醫大學提供，許可證號：SCXK(渝)20120005。交配后所生48 h內的新生鼠96只，隨機分為八組。對照組手術操作顯露左輸尿管后即關腹；實驗組采用腰大肌壓迫法，建立左輸尿管不全梗阻的新生鼠腎積水動物模型[2]，飼養3周后行手術解除輸尿管梗阻，再隨機分為模型組、干預組。對照組、模型組皮下注射生理鹽水(1.0 mL·kg-1·d-1)，干預各組：黃芪低劑量及高劑量組、冬蟲夏草低劑量及高劑量組、聯合用藥(黃芪+冬蟲夏草)低劑量及高劑量組，相應以1 mL·kg-1·d-1、3 mL·kg-1·d-1、0.5 mL·kg-1·d-1、2 mL·kg-1·d-1、(1 mL·kg-1·d-1+0.5 mL·kg-1·d-1)、(3 mL·kg-1·d-11+2 mL·kg-1·d-1)進行皮下注射，持續干預9周。然后麻醉下游離、切除左側腎臟并處死動物，經腎門將腎臟縱向切開分為兩部分，一部分用10%中性甲醛固定12 h行石蠟包埋，待病理學及免疫組化檢測；另一部分橫切后再分為兩份，經生理鹽水漂洗后，一份立即放入-80℃冰箱中凍存，待Western blot檢測，剩余部分剪碎放入加有1mL RNA-Trizol的EP管中、-80℃冰箱凍存，待RT-PCR檢測。同時收集腎盂尿液、ELISA法檢測尿TGF-β1、IGF-1水平。

1.2實驗方法

1.2.1患腎組織結構的變化(HE染色) 各組腎臟組織經切片、蘇木素/伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)后，在光學顯微鏡下觀察腎小球、腎小囊、腎小管以及腎間質組織結構變化。

1.2.2免疫組織化學(IHC) 切片梯度脫蠟至水，3%過氧化氫孵育消除內源性過氧化物酶，抗原修復后山羊血清封閉抗原，分別加 IGF-1、TGF-β1抗體(稀釋濃度均為1：100)、4℃過夜，PBS清洗后滴加二抗，37℃孵育30 min，PV-6001免疫組化染色試劑盒顯色，蘇木素復染，梯度脫水透明，樹膠封片。結果判定：在光鏡下觀察各組免疫組化切片IGF-1、TGF-β1表達情況，出現棕黃色顆粒為陽性結果。在400倍視野下，每張切片隨機選取5個互不重疊的區域，應用Image-ProPlus(Version6.0)圖像分析軟件(IPP6.0)進行圖像分析，并測每張圖像陽性細胞的光密度(Optical Density，OD)，計算平均值。

1.2.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR) IGF-1上游引物5’TGG CAC TCT GCT TGC TCA C 3’，下游引物5’GGT CCA CAC ACG AAC TGA AG 3’；TGF-β1：上游引物5’TGG AGC CTG GAC ACA CAG TA 3’，下游引物5’CGT AGT AGA CGA TGG GCA GTG 3’；β-actin：上游引物5’TGG CAC TCT GCT TGC TCA C 3’，下游引物5’ GGT CCA CAC ACG AAC TGA AG 3’。擴增采用20 μL反應體系，經 95℃變性5 s，60℃延伸30 s，擴增40個循環，設置PCR基線，記錄各個標本的Ct值。結果應用N=2-ddCt計算基因的相對表達量Ct average=(Ct1+Ct2)/2 (復管)；dCt= Ct average-中間值；基因表達=2-dCt；相對定量=(目的基因的表達/內參基因的表達)×100。

1.2.4蛋白印跡(Western blot) 取-80℃冰箱凍存腎臟標本，按照組織蛋白提取試劑盒說明步驟，加入組織裂解液和蛋白酶抑制劑混合物，冰上研碎、勻漿后，以12 000 r/min、4℃離心5 min，取上清液，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸5 min。制作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，每個標本蛋白上樣量為12.5 μL，60V恒壓電泳，220 mA恒流轉膜，將膜置于封閉液中常溫封閉1 h后，一抗(5%牛血清白蛋白稀釋濃度：IGF-1、TGF-β1、β-actin稀釋比例均為1：1 000)孵育，4℃靜置過夜。洗膜后置于二抗(TBST稀釋，濃度為1：1 000)中室溫孵育2 h。膜上滴加ECL發光試劑，充分接觸、反應。然后放入全能型凝膠成像分析系統中進行掃描成像，并分析其蛋白表達量(相對恢度值)。

1.2.5酶聯免疫吸附法(ELISA) 鼠IGF-1、TGF-β1酶聯免疫試劑盒做ELISA反應，用ELX-800型酶標儀檢測OD450值。

2 結 果

2.1病理學檢查 肉眼觀：對照組雙腎大小、形態一致，包膜光滑，腎實質質地對等；模型組患腎仍大，腎實質薄，腎盂擴張、積水減輕；干預組患腎大，但較模型組患腎小、恢復快，腎實質仍薄，腎盂擴張、積水明顯減輕。鏡下觀：對照組：雙腎小球、腎小管發育好、形態正常，腎小囊未見擴張；模型組：患腎腎小球形態改善，腎小球鮑曼氏囊及腎小管仍擴張，腎間質纖維化、炎細胞浸潤減輕；干預組：患腎腎小球形態明顯改善，腎小球鮑曼氏囊及腎小管輕度擴張，但患腎損害恢復程度明顯優于模型組(圖1)，且隨藥物劑量的增大、以及聯合用藥，患腎組織結構損害后的恢復程度加快。

注：a.對照組HE染色：術后9周時左腎腎小球、腎小管結構發育正常，腎間質未見纖維化；b.梗阻解除后模型組：梗阻解除9周，左腎腎小球形態改善，腎小囊及腎小管擴張，腎間質纖維化、細胞浸潤減輕；c.梗阻解除后干預組：梗阻解除皮下注射藥物9周，左腎腎小球形態明顯改善，腎小囊及腎小管擴張明顯減輕。圖1 病理學檢查(HE×400)

2.2IHC及RT-PCR檢測結果 對照組腎組織IGF-1高表達、TGF-β1低表達(圖2a～b)，模型組患腎組織IGF-1低表達、TGF-β1高表達，以腎小管胞漿內出現棕褐色顆粒為陽性(圖2c～d)。干預各組IGF-1、TGF-β1均有不同程度表達(圖2e～f)。應用Image-ProPlus圖像分析軟件測量的光密度值及RT-PCR檢測IGF-1mRNA、TGF-β1mRNA(表1)。對照組腎組織內IGF-1、TGF-β1光密度及其mRNA與相應模型組、模型組與干預各組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；對照組與干預各組、干預各組內IGF-1、TGF-β1光密度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但隨藥物劑量增大、聯合用藥，IGF-1表達增高，TGF-β1表達減低。

注：a.對照組IGF-1：假手術后9周IGF-1腎小管強陽性表達，但腎小球未見表達，腎小球正常；b.對照組TGF-β1：假手術后9周，TGF-β1腎小管低表達；c.梗阻解除后模型組 IGF-1：梗阻解除后9周，腎小管內弱陽性表達，腎小球內未見表達；d.梗阻解除后模型組TGF-β1：梗阻解除后9周，腎小管及腎血管內皮細胞強陽性表達；e.干預組IGF-1：梗阻解除皮下注射藥物9周，腎小管內陽性表達，腎小球內未見表達；f.干預組TGF-β1：梗阻解除皮下注射藥物9周，腎小管及腎血管內皮細胞陽性表達。圖2 IHC及RT-PCR檢測結果(×400)

表1 各組患腎組織IGF-1、TGF-β1光密度值及TGF-β1mRNA、IGF-1mRNA表達

2.3Western blot檢測結果 對照組患腎組織IGF-1蛋白表達量高、TGF-β1蛋白表達量低；模型組患腎組織IGF-蛋白表達量低、TGF-β1蛋白表達量高。干預各組IGF-1、TGF-β1蛋白均有不同程度表達(圖3)。IGF-1、TGF-β1蛋白的表達量，在對照組與模型組、模型組與各干預組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；在對照組與各干預組間、各干預組內比較差異無統計學意義(P>0.05)，但隨著藥物劑量增大、聯合用藥，IGF-1蛋白表達量增高，TGF-β1蛋白表達量減低。見表2。

注：1.黃芪低劑量組；2.黃芪高劑量組；3.蟲草低劑量組；4.蟲草高劑量組；5.(黃芪+蟲草)低劑量組；6.(黃芪+蟲草)高劑量組；7.對照組；8.模型組。圖3 實驗各組腎組織IGF-1、TGF-β1、β-actin蛋白表達結果

表2 實驗各組患腎組織IGF-1、TGF-β1蛋白表達變化

2.4ELISA檢測結果 對照組尿IGF-1高、TGF-β1低，模型組患腎尿IGF-1低、TGF-β1高；干預各組尿IGF-1、TGF-β1水平介于對照組與模型組之間。對照組尿IGF-1、TGF-β1水平與相應模型組、模型組與干預各組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；對照組與干預各組間、干預各組組內比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 實驗各組患腎尿IGF-1、TGF-β1的水平

3 討 論

UPJO所致小兒先天性腎積水臨床常見，對中、重度腎積水大多需進行離斷性腎盂輸尿管成形術(Anderson-Hynes術)[3-4]。但在術后臨床隨訪時，發現部分患兒受損的腎功能恢復極其緩慢，甚至未見明顯改善。黃芪有改善微循環、減少尿蛋白及利尿作用，能減輕腎小球硬化和腎間質纖維化，對慢性腎病如糖尿病腎病、高血壓腎病等的腎損害具有治療作用。另有研究[5-6]表明，冬蟲夏草能延緩腎小球的硬化，防治腎小球、腎小管間質纖維化，并對慢性腎小球腎炎等慢性腎病也有治療作用。本課題組前期研究表明，黃芪、冬蟲夏草可能通過調控腎積水病腎組織TGF-1和IGF-1的表達，以減輕病腎的損害，對病腎組織起到保護保用[7]。故此本研究以動物模型為切入點，應用黃芪、冬蟲夏草對先天性腎積水梗阻解除后的模型進行干預，以觀察能否促進患腎功能的有效恢復。

本研究通過建立新生鼠輸尿管不全梗阻解除后的動物模型，模擬了小兒腎積水經手術解除梗阻的病情；干預組隨后應用不同劑量黃芪、冬蟲夏草對動物模型進行干預處理，對患腎行病理檢查。結果表明：干預組患腎較對照組大，但小于模型組；干預組、模型組患腎盂擴張、積水，但前者腎臟受壓和積水程度較后者輕。鏡下觀察見對照組雙腎小球、腎小管發育正常，鮑曼氏囊無擴張；模型組腎小球形態改善，腎小球鮑曼囊及腎小管仍擴張，腎間質炎細胞浸潤及纖維化；干預組腎小球形態明顯改善，腎小球鮑曼氏囊、腎小管擴張及腎間質纖維化程度低，炎細胞浸潤減少，干預組患腎損害恢復明顯優于模型組。表明：黃芪、冬蟲夏草對腎積水梗阻解除模型患腎損害的恢復具有促進作用。

胰島素樣生長因子IGF-1是體內重要的促有絲分裂原，參與多種腎臟疾病的發展過程，與腎間質纖維化密切相關，能延緩纖維化進程[7]。注射IGF-1能夠減少腎間質膠原聚集，抑制腎小管細胞凋亡和腎小管萎縮，具有對抗腎間質纖維化的作用。應用IGF-1受體抗體治療也可以減少細胞外基質的增殖，減輕腎臟組織纖維化[8]。而轉化生長因子-β在細胞分化增殖、細胞外基質形成和胚胎發育中發揮著重要作用，TGF-β1是體內最主要的致纖維化因子，參與了腎間質纖維化的發生、發展過程。研究表明：TGF-β1能刺激腎間質細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞合成層粘連蛋白、纖維連接蛋白和膠原纖維，促進細胞外基質(ECM)的分泌和聚積，并使纖維細胞增殖、活化為成纖維細胞，從而導致 ECM的降解酶—基質金屬蛋白酶(MMP)表達減少[9]。TGF-β1/Smad通路在腎臟纖維化的發生、發展起到非常重要的作用。所以，抑制TGF-β1對靶基因及腎組織的影響是腎臟疾病腎功能恢復的重要因素。

本研究應用黃芪、冬蟲夏草對先天性腎積水梗阻解除動物模型進行相應處理，發現對照組腎組織IGF-1表達升高、TGF-β1表達降低，模型組患腎組織IGF-蛋白低表達、TGF-β1高表達，干預各組IGF-1、TGF-β1不同程度表達。原因可能是輸尿管不全梗阻解除后，應用黃芪、冬蟲夏草刺激機體可促進腎臟組織通過自分泌和旁分泌的形式，致使腎臟組織中IGF-1的表達量增多；另一方面可能通過增強IGFBPs水解酶的活性，把體循環結合的IGF-1釋放出來，輸送至腎臟靶組織中，增強IGF-1與IGF-1受體相互作用率，促進腎小管上皮細胞生長、增殖，抑制腎小管萎縮。與此同時，黃芪、冬蟲夏草提取液可能通過阻礙TGF-β1/Smad信號傳導通路，導致抑制性Smad蛋白(Smad7)激活，進一步阻止信號傳導，抑制層粘連蛋白、膠原纖維等的分泌，阻止腎間質纖維化，從而加速輸尿管梗阻解除后，患腎損害的有效恢復。此外，在研究過程中也證實，對新生鼠腎積水動物模型，解除梗阻仍是治療的主要手段。這與臨床對小兒腎積水，手術解除梗阻治療的療效一致[10]。但在手術治療的基礎上，應用黃芪、冬蟲夏草可促進新生鼠腎積水梗阻解除后，加速患腎功能的有效恢復。進一步應用ELISA法檢測患腎尿IGF-1、TGF-β1水平發現，干預各組尿IGF-1、TGF-β1水平介于對照組與模型組之間。對照組尿IGF-1、TGF-β1與相應模型組、干預各組間比較，差異均有統計學意義，這進一步證實用黃芪、冬蟲夏草還可通過調控新生鼠尿IGF-1、TGF-β1水平的變化，利于患腎損害的有效恢復。

綜上所述，對UPJO致先天性腎積水行手術解除梗阻后，應用黃芪、冬蟲夏草進行相應干預，可促進患腎損害的有效恢復，其機制可能是通過上調患腎組織內IGF-1的表達、和/或下調病腎TGF-β1表達，從而促進、加速患腎損害的有效康復。