不同激素對烏腺金絲桃愈傷組織誘導與增殖的影響

于風馳,李自強,李昊陽,王鐸森,劉曉丹

(吉林農業科技學院，吉林 吉林 132101)

1 引言

金絲桃屬(HypericumL.)中特有的活性成分金絲桃素，具有明顯的抗病毒、抗抑郁作用，同時可增強免疫力[1]；其中藥制劑也可作為獸藥。長白山地區具有豐富的野生金絲桃資源，主要是長柱金絲桃、短柱金絲桃和烏腺金絲桃，其中烏腺金絲桃在吉林省具有廣泛的分布。

利用植物細胞培養技術大規模生產具有重要經濟價值的天然活性成分為中草藥的可持續發展提供了一條新的途徑。多年來，對金絲桃素的需求持續攀升，國內外有關金絲桃屬離體培養的研究也隨之大幅增加[1,2]。

本研究以金絲桃素含量較高的烏腺金絲桃為試材，探討不同激素配比對烏腺金絲桃愈傷組織誘導與增殖的影響，最終建立烏腺金絲桃愈傷組織誘導和增殖培養體系。可為將來烏腺金絲桃懸浮細胞培養體系的建立提供優質的細胞資源。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

植物材料：烏腺金絲桃無菌苗。

主要試劑：MS培養基(青島海博)，2,4-D、6-BA 及KT等激素(上海綠葉)。

2.2 方法

2.2.1 外植體的獲得

在超凈工作臺中，將烏腺金絲桃無菌苗幼嫩的葉片進行切割，由于無菌苗較小，切割時可以帶有部分莖段，長度約1 cm備用。

2.2.2 愈傷組織的誘導

借鑒已報道的文獻[3,4]，采用4種愈傷誘導培養基激素組合：1號：2,4-D 0.6 mg/L+ KT 0.4 mg/L；2號：2,4-D 0.6 mg/L+6-BA 0.4 mg/L；3號：2,4-D 1.2 mg/L+ KT0.2 mg/L；4號：2,4-D1.2 mg/L+6-BA 0.2 mg/L。將上步準備的外植體接種到1～4號培養基中，每瓶接種10個左右材料，每種培養基接種10瓶，(25±1)℃，避光培養 15 d后，統計誘導率，確定最佳的激素配比。誘導率=(愈傷總數/外植體總數)×100%。

2.2.3 愈傷組織的增殖

考慮不同分裂素的激活作用不同，設計6種增殖培養基激素組合：5號：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.2 mg/L；6號：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.2 mg/L；7號：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.4 mg/L；8號：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L；9號：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.6 mg/L；10號：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.6 mg/L。將上步形成的愈傷切割成0.5 cm2的小塊，接種到5～10號培養基中，每個培養瓶中接種5塊，每種培養基接種10瓶，每15 d轉接一次。接種 6周后，統計增殖率。分析不同激素配比對愈傷增殖的影響，確定烏腺金絲桃愈傷的增殖最適培養基配方。增殖倍數=轉瓶后愈傷鮮重/轉瓶前愈傷鮮重。

3 結果與分析

3.1 不同激素組合對烏腺金絲桃愈傷組織的影響

將烏腺金絲桃無菌苗的葉片接種到不同愈傷組織誘導培養基中，(25±1)℃，培養 15 d 后統計愈傷組織誘導率，結果見表1。

表1 不同激素對愈傷組織誘導的影響

當2,4-D濃度水平一致時時，細胞分裂素KT對愈傷組織的誘導率明顯好于6-BA。而對比不同濃度生長素2,4-D對誘導率的影響，發現濃度為0.6 mg/L時形成的愈傷組織質地疏松且生長快，僅有少量褐化，更適合烏腺金絲桃愈傷組織的誘導(圖1)，其中1號培養基中愈傷組織誘導率最高，最終確定最佳激素配比即為2,4-D 0.6mg/L +KT 0.4 mg/L。

圖1 烏腺金絲桃愈傷組織誘導結果

3.2 不同激素組合對烏腺金絲桃愈傷組織增殖的影響

在不同增殖培養基中，培養60 d后，統計結果如表2。激素組合為2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L時，愈傷組織的增殖倍數最高，達7.2。在2,4-D濃度相同的條件下，兩種細胞分裂素的濃度由0.2 mg/L增加至0.4 mg/L時，增殖倍數均明顯增大；對比相同濃度水平下KT與TDZ對增殖倍數的影響，TDZ的效果更好。當兩種細胞分裂素的濃度均提高到0.6 mg/L時，愈傷組織的增殖率反而下降。最終確定8號培養基為最佳激素組合，即2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L。

表2 不同激素比對愈傷組織增殖的影響

4 討論

外源激素的種類與濃度對不同植物愈傷組織的誘導與增殖中發揮關鍵作用。作金絲桃屬植物愈傷的誘導和增殖中，激素的組合和配比差異顯著。李景原2000年對貫葉金絲桃細胞培養中發現，當激素配比為2,4-D1 mg/L+NAA1 mg/L時愈傷組織的誘導率高達92.86%[5]；而許明淑2001年對貫葉金絲桃研究結果表明，激素配比為2,4-D2.0 mg/+6-BA2.0 mg/L時誘導形成愈傷組織最多[6]；張娜在2005年對貫葉連翹進行愈傷組織誘導時發現，培養基為MS+2,4-D 0.2 mg/L+KT0.02 mg/L時，效果最好[7]。于曉坤2012年在貫葉連翹愈傷組織培養時發現，KT 濃度為0.02 mg/L時適宜增殖[8]。

本試驗以金絲桃素含量較高的烏腺金絲桃為材料，成功建立其愈傷組織培養體系；以此為出發材料，目前項目組正在進行懸浮細胞培養體系研究，以期為工業化大規模合成并生產金絲桃素提供理論參考。