醬醪配制階段添加良性乳酸菌解決醬油二次沉淀的研究

滑歡歡 王聰 扈圓舒 符姜燕 李婕

摘 要：根據乳酸菌顯微鏡細胞形態、耐鹽性試驗、產物中有害物質含量（組胺和酪胺），從菌種庫3株乳酸菌中鑒定出R3為良性乳酸菌;通過擴大培養工藝，使得R3乳酸菌培養液的細胞數達到109;將培養液在醬醪配制階段添加至醬醪中，發酵180d后，試驗罐的天然油的二次沉淀是對照樣的10%。

關鍵詞：良性乳酸菌;細胞形態;耐鹽性試驗;組胺和酪胺

中圖分類號 TS264文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）09-0131-04

Study on a Long-term Preservation Method of Aspergillus

Hua Huanhuan et al.

（Guangdong Meiweixian Flavoring Foods Co.， Ltd.， Zhongshan 528400， China）

Abstract： Brown rice with water to cook for 15min， the boiled brown rice and bran are mixed with 5∶1 by weight，taking them into the flask. Each triangular flask has a thickness of 7-10cm medium，triangle bottle with tampons and kraft paper seal，sterilization at 121℃ 20min. Inoculated with Aspergillus oryzae in the Erlenmeyer flask， 35℃ culture 72h. The mature Aspergillus oryzae was vacuum dried to about 10% moisture， the dried bacteria were stored in a refrigerator at-20℃， save for up to 20 years.

Key words： Btown rice; Vacuum dry; Dry and frozen

1 引言

醬油是人們生活所必需的調味品之一，我國每年均會大量出口醬油。雖然我國出口的醬油都是選用上等原料生產的，產品出廠經嚴格滅菌、過濾、檢測等工序，出口時無沉淀物，但經一段時間庫存和銷售的醬油有二次沉淀析出，使醬油質量下降，從而影響了醬油在國際市場的競爭力。醬油在生產和儲存的各個階段都可能產生沉淀，從發酵罐中放出來的未經滅菌的醬油稱為原油，這種原油產生的沉淀稱為原沉淀;原油加熱處理后，放置一段時間后生成的沉淀物稱為一次沉淀;成品醬油在儲存或貨架銷售過程中產生的沉淀為二次沉淀。二次沉淀的產生是當今我國醬油行業普遍存在的尚未解決的一大難題。經顯微鏡檢測及成分分析，二次沉淀主要是大量菌體聚集而成，其次是原料中未分解的蛋白質組成。

本研究旨在提供一種醬醪中添加良性乳酸菌，以抑制惡性乳酸菌的增殖，從而減少醬油中的惡性乳酸菌菌體;惡性乳酸菌細胞單個、分散的存在于醬醪中，良性乳酸菌細胞幾個連接在一起，成團存在于醬醪中。原油過濾時，可以將良性乳酸菌的菌體除去，進而解決醬油二次沉淀的問題。

2 材料與方法

2.1 供試材料 釀造醬油生產原料：黃豆、面粉、麩皮，從市場采購。乳酸菌：廣東美味鮮調味食品有限公司菌種庫提供。酵母抽提物、牛肉膏、蛋白胨、磷酸二氫鉀等試劑：由廣州化學試劑廠提供。

2.2 主要設備 顯微鏡、培養箱、超凈工作臺、NK式蒸煮鍋、發酵池、發酵罐。

2.3 培養基 配方1（MRS培養基）：酪蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸二胺2g、吐溫801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g、瓊脂20g、氯化鈉58.5g、蒸餾水1000mL，pH6.8。配方2（番茄汁瓊脂培養基）：酵母抽提物5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氫二鉀2g、吐溫801g、乙酸鈉5g、瓊脂15g、番茄汁50mL、加水至1000mL，pH6.8。配方3（番茄醬瓊脂培養基）：蛋白胨20g、牛肉膏3g、酵母膏3g、番茄醬100g、乳糖20g、氯化鈉5g、碳酸鈣10g、加水至1000mL，pH6.8。

2.4 試驗方法

2.4.1 乳酸菌分離純化培養基配方的確定 配方1（MRS培養基）：酪蛋白胨10g、牛肉浸取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸鈉5g、檸檬酸二胺2g、吐溫801g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.2g、七水硫酸錳0.05g、瓊脂20g、氯化鈉58.5g、蒸餾水1000mL，pH6.8。配方2（番茄汁瓊脂培養基）：酵母抽提物5g、牛肉膏10g、乳糖20g、葡萄糖2g、磷酸氫二鉀2g、吐溫801g、乙酸鈉5g、瓊脂15g、番茄汁50mL、加水至1000mL，pH6.8。配方3（番茄醬瓊脂培養基）：蛋白胨20g、牛肉膏3g、酵母膏3g、番茄醬100g、乳糖20g、氯化鈉5g、碳酸鈣10g、加水至1000mL，pH6.8。

2.4.2 乳酸菌分離純化方法的確定 方案1（稀釋涂布法，有氧培養）：（1）將分別盛有9mL生理鹽水的6支試管滅菌，并按順序進行編號;（2）用移液管吸取1mL培養的菌液，注入試管中，用手指輕壓移液管上的橡皮，吹吸3次，使菌液與水充分混勻;（3）從10-1倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入10-2倍稀釋的試管中，重復第2步的混勻操作，以此類推，直到完成最后1支試管的稀釋;（4）取少量菌液滴加在培養基表面，用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基表面方案2（二重皿扁平培養法，見圖1厭氧培養）：將干熱滅菌的培養皿的蓋皿，按常法進行平板培養，流入培養基還沒有凝固前，將底皿的底面壓入蓋皿培養基內，令其凝固，蓋皿和底皿之間的空隙則用熔化的石蠟加以密封，隔絕空氣，將其放在無菌大型培養皿內。

2.4.3 通過乳酸菌顯微鏡細胞形態確定乳酸菌的優劣 通過顯微鏡檢測乳酸菌的細胞形態，幾個細胞粘連在一起的乳酸菌稱為良性乳酸菌。使用顯微鏡對經相同條件下（相同培養基、相同培養溫度和無氧條件）擴大培養的3株乳酸菌培養液進行鏡檢，步驟如下：（1）配制1.5LMRS液體培養基，分裝于3個1L的三角瓶中，每個三角瓶裝500mL;（2）將分裝好的培養基于121℃、滅菌30min，冷卻，備用;（3）將3株乳酸菌分別接種于滅過菌的培養基中，于35℃培養5d;（4）將蓋玻片用酸洗液浸泡10s左右，用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗，用擦鏡紙擦拭干凈。此步驟中不能用酒精點燃殺菌，否則蓋玻片會斷裂;（5）用滴管滴半滴蒸餾水于載玻片上，使用滅過菌玻璃吸管吸取培養物，滴一滴培養物于載玻片上;（6）蓋上蓋玻片，確保無氣泡;（7）觀察細胞形態，拍照。

2.4.4 通過耐鹽性試驗確定3株乳酸菌的優劣 （1）配制1.5L高鹽分的乳酸菌擴大培養基（頭油10%、葡萄糖5%、鹽分18%），分裝于3個1L的三角瓶中，每個三角瓶裝500mL;（2）將分裝好的培養基于121℃、滅菌30min，冷卻，備用;（3）將3株乳酸菌分別接種于滅過菌的培養基中，于35℃培養5d，每天檢測培養物的pH和細胞數;（4）通過檢測培養物的pH和細胞數，確定這3株乳酸菌在高鹽培養基條件的生長情況;（5）選出耐鹽性強的乳酸菌，更適于醬油釀造。

2.4.5 通過檢測產物中有害物質的含量（組胺和酪胺）判斷乳酸菌優劣 （1）實驗室規模制作大曲：蒸熟的黃豆與面粉按照1∶0.4比例混合，接種米曲霉3.042，裝入鋁飯盒中于30℃恒溫培養44h，制得成熟的大曲;（2）實驗室規模制醪：取150g大曲與450g23波美的鹽水混合制成醬醪，裝于1個1L三角瓶種;（3）分別取實驗例2中培養好的3種乳酸菌添加至3瓶醬醪中，使得每瓶醬醪中乳酸菌的細胞數達到106，以不添加乳酸菌的那瓶醬醪為對照樣;（4）將添加乳酸菌的醬醪放置在30℃培養箱，恒溫發酵30d，每10d檢測上清液的pH，發酵完成后，檢測上清液中組胺和酪胺的含量，進而判斷這3株乳酸菌的優劣。

2.4.6 篩選出的良性乳酸菌R3應用于醬油釀造解決二次沉淀問題 （1）將乳酸菌R3按照以上擴大培養的方法擴大培養，使得細胞數達到109;（2）將培養好的乳酸菌R3添加至的面積為65m2的發酵罐的醬醪中，使得醬醪中的細胞數為106，添加時機為醬醪配制階段添加乳酸菌;（3）以同一天投料的，未添加乳酸菌的65m2發酵罐為對照罐;（4）發酵過程管理：發酵時間為3d、7d、15d、30d、45d、60d、90d復油攪拌醬醪，發酵180d放出頭油;（5）用0.1μm膜過濾法過濾天然油，過濾后的天然油經煮制、調配、熱沉3d，取上清液，裝入玻璃瓶，封口，常溫放置60d，觀察醬油的二次沉淀。

3 結果與分析

3.1 乳酸菌分離純化培養基的配方 由表1可知：用配方1分離純化得到的乳酸菌細胞數最多，說明培養基配方1最適用于乳酸菌的生長。

3.2 乳酸菌分離純化的方法 由圖2、圖3及表2可知：分離純化乳酸菌時，用二重皿扁平培養法得到的細胞數高于稀釋涂布法。說明乳酸菌在厭氧條件下生長的好，乳酸菌擴大培養時，需厭氧培養。

3.3 3株乳酸菌的細胞形態 圖4是在中國微生物網購買的嗜鹽片球菌，命名為R1，從細胞形態看，單個細胞排列、較分散;圖5是上海微生物釀造研究所購買的乳酸菌，命名為R2，從細胞形態看，是乳酸菌桿菌;圖6是我司醬醪中分離得到的乳酸菌，命名為R3，從細胞形態看，是幾個細胞連接在一起的片球菌。由此可見，醬醪中分離得到的乳酸菌為良性乳酸菌，更適于醬油釀造解決二次沉淀。

3.4 3株乳酸菌的耐鹽性 由表3可知，R1和R2這2株乳酸菌在高鹽條件下擴大培養時，pH值下降緩慢，說明其生長繁殖較慢，產乳酸的含量低，乳酸菌R3更適合生長于高鹽的培養基，pH下降快速，說明其繁殖能力強。由表4可知，R1和R2這2株乳酸菌在高鹽條件下擴大培養時，細胞增殖較慢，培養至5d時細胞數為107，乳酸菌R3培養至5d時細胞數為109，達到目標值，說明醬醪分離得到的乳酸菌更適合生長于高鹽培養基。

由表5可知，添加乳酸菌R3發酵的水黃中組胺和酪胺含量最少，說明乳酸菌R3更適于醬油釀造。

3.5 乳酸菌R3解決醬油釀造解決二次沉淀的效果 由表6可知，添加乳酸菌R3發酵的醬油二次沉淀析出的時間比未添加乳酸菌的醬油晚，且放置60d時添加乳酸菌的醬油二次沉淀減少很多。試驗證明，添加良性乳酸菌可以解決醬油中的二次沉淀問題，同時充分說明醬油中的二次沉淀主要是由惡性乳酸菌的菌體構成的。

4 結論

以MRS培養基配方及二重皿扁平培養法分離得到的3株乳酸菌，根據乳酸菌的顯微鏡細胞形態、耐鹽性試驗、產物中有害物質含量（組胺和酪胺），鑒定出乳酸菌R3（公司醬醪中分離得到的乳酸菌）為良性乳酸菌;通過擴大培養工藝，使得R3乳酸菌培養液的細胞數達到109;將培養液在醬醪配制階段添加至醬醪中，發酵180d后，試驗罐的天然油的二次沉淀是對照樣的10%。

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（責編：張宏民）