硝酸鑭對(duì)急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用研究

李睿珺， 周雅琳， 劉 偉， 李 雍， 秦 勇， 于蘭蘭， 陳宇涵， 許雅君，2*

（1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京100191；2.食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100191）

肝臟是乙醇代謝的主要器官，也是乙醇毒性的主要靶點(diǎn)。在肝臟中，乙醇被代謝成有毒的代謝產(chǎn)物乙醛，乙醛與細(xì)胞大分子（脂質(zhì)和蛋白質(zhì)）相互作用，激活促炎轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而引起肝損傷（Jaruga等，2004）。由乙醇引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）過量產(chǎn)生且不能被及時(shí)清除的氧化應(yīng)激是酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制之一（Li等，2018；李大偉等，2014；Xu 等，2014；Jin 等，2013）。 研究表明，乙醇能降低SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）和GSH含量，因此，提高抗氧化能力可有效保護(hù)肝細(xì)胞免受乙醇的損傷（Sid等，2013）。氧化應(yīng)激還可以引起脂質(zhì)過氧化，形成具有肝毒性的MDA（Ayala等，2014）。除了ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激，乙醛誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子也可導(dǎo)致過氧化產(chǎn)物的生成，從而引起肝臟損傷（Zhou等，2017）。

稀土元素是17種有相似原子結(jié)構(gòu)和離子半徑的特殊元素的統(tǒng)稱，分為輕稀土和重稀土兩類。已有研究表明，稀土元素具有抗氧化的作用。申秀英等（2004）研究表明，低劑量釤在一定范圍內(nèi)能提高SOD的活力，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，對(duì)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有一定的抑制作用。夏青等（2008）研究指出，低濃度的鈰離子可減少脂質(zhì)過氧化損傷。李樹蕾等（2001）研究表明，0.1 mg/kg和2.0 mg/kg的硝酸稀土可增強(qiáng)胃黏膜的抗氧化能力，并抑制脂質(zhì)過氧化進(jìn)程。屈艾等（2005）研究指出，鈥元素在一定的劑量范圍內(nèi)有抗氧化損傷的作用，能增強(qiáng)抗氧化酶的活性。王春霞等（2000）研究表明，硝酸稀土鑭、鐠、釹、釤、鐿、釔能抑制超氧陰離子并存在劑量反應(yīng)關(guān)系。作為廣泛使用的輕稀土元素，鑭是稀土元素中最具反應(yīng)性的一種（Zheng等，2013），其分子結(jié)構(gòu)和離子半徑與鈣離子非常相似，化學(xué)性質(zhì)活潑，被稱為超級(jí)鈣，并因其毒性較低被廣泛用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)研究。

關(guān)于硝酸鑭改善乙醇所致的急性肝損傷鮮有報(bào)道，已有的試驗(yàn)也缺乏對(duì)硝酸鑭保護(hù)作用的最優(yōu)效應(yīng)劑量的研究。故本試驗(yàn)以硝酸鑭為研究對(duì)象，給小鼠連續(xù)灌胃30 d后，建立急性肝損傷模型，觀察不同劑量下硝酸鑭對(duì)小鼠血清ALT和AST，血清和肝臟T-SOD、GSH、MDA的影響，為探究硝酸鑭對(duì)乙醇所致的急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及最佳作用劑量提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 硝酸鑭 （純度≥99.99%，CAS：10277-43-7，美國 Sigma公司）。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測(cè)試盒 （C009-2-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶 （AST）測(cè)試盒（C010-2-1）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒（A001-3）、谷胱甘肽（GSH）測(cè)試盒（A006-2）、丙二醛 （MDA）測(cè)試盒 （A003-1）、蛋白定量測(cè)試盒（A045-2），均購自南京建成生物工程研究所。

電子天平（SPN3001F，美國奧豪斯），電熱恒溫水浴鍋（HH·S11-1，北京長安科學(xué)儀器廠），全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀 （MULTISKAN MK3，美國Thermo），低溫自動(dòng)平衡離心機(jī)（BFX5-320，白洋離心機(jī)廠），紫外分光光度計(jì)（UV-2000，美國UNIC），高速勻漿機(jī)（T18，德國 IKA 公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件 健康SPF級(jí)雄性ICR 小鼠 84 只，體重（33.0±3.0）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部試驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXX（京）2016-0010]。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障環(huán)境，溫度控制在（23±2）℃，相對(duì)濕度為50%～60%，晝夜照明時(shí)間為12 h:12 h。

1.2.2 試驗(yàn)分組及模型建立 試驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，稱量其體重作為初始體重，并按體重隨機(jī)分為空白組，模型組及硝酸鑭A、B、C、D和E組 （稱取相應(yīng)質(zhì)量的硝酸鑭加入蒸餾水中配制而成），每組各12只。硝酸鑭A到E組分別給予相應(yīng)劑量的硝酸鑭溶液灌胃，空白組和模型組經(jīng)口灌胃蒸餾水，灌胃體積為0.1 mL/10 g，連續(xù)灌胃30 d，各組均給予維持飼料，灌胃期間自由進(jìn)食和飲水。末次灌胃后，模型組和5個(gè)硝酸鑭干預(yù)組隔夜禁食 （16 h），然后一次性給予50%的乙醇12 mL/kg灌胃，6 h后殺鼠取材并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。試驗(yàn)分組及受試樣品給予見表1。

表1試驗(yàn)分組及受試樣品給予

1.2.3 測(cè)試樣品的制備 乙醇灌胃6 h后，試驗(yàn)動(dòng)物摘眼球取血并斷頸處死，留取血液和肝臟組織。將血液靜置1 h后，3000 r/min離心10 min，留取上清液備用。摘取的肝臟組織先在預(yù)冷的0.9%生理鹽水里漂洗并用濾紙吸干其表面水分，稱取小部分肝組織并加入其9倍體積的生理鹽水，在冰水浴中用組織勻漿機(jī)制備肝臟勻漿，3000 r/min離心10 min，留取上清液備用。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.4.1 體重、食物利用率、肝臟質(zhì)量和肝臟系數(shù)適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，對(duì)小鼠稱重，記為初始體重并根據(jù)體重隨機(jī)分組，每隔7 d在同一時(shí)間稱量小鼠體重和食物消耗量，并根據(jù)小鼠體重增量（g）和食物消耗量（100 g）計(jì)算食物利用率。稱量小鼠肝臟質(zhì)量，并根據(jù)肝臟質(zhì)量（g）和小鼠處死前體重（g）計(jì)算肝臟系數(shù)。

1.2.4.2 血清和肝臟組織檢測(cè) 采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒檢測(cè)血清和肝組織的相應(yīng)指標(biāo)：血清ALT和AST、血清和肝臟T-SOD、GSH、MDA及肝組織蛋白含量。按照試劑盒的操作步驟對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。采用微板法測(cè)定ALT和AST的活力。采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測(cè)定T-SOD活力。采用比色法測(cè)定GSH含量，原理為二硫代硝基苯甲酸與硫基化合物反應(yīng)時(shí)能產(chǎn)生一種黃色化合物，其吸光度反映了GSH的含量。用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定MDA的含量。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量三次并計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果均為連續(xù)變量，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。所有數(shù)據(jù)均用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析 （one-way ANOVA）比較組間差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。方差齊時(shí)，用SNK法進(jìn)行兩兩比較；方差不齊時(shí)，用Tamhane’s法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重和食物利用率 由表2和圖1可知，各組小鼠體重隨試驗(yàn)時(shí)間的延長而增加，各組小鼠的體重和食物利用率均無顯著差異（P＞0.05），試驗(yàn)期間，動(dòng)物狀態(tài)良好，無異常表現(xiàn)，表明硝酸鑭在本試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠的生長發(fā)育無不良影響。

表2硝酸鑭對(duì)小鼠體重的影響 g

2.2 肝臟質(zhì)量和肝臟系數(shù) 如表3所示，與空白組相比，模型組肝臟質(zhì)量和肝臟系數(shù)顯著增加（P＜0.01），說明乙醇會(huì)導(dǎo)致小鼠肝臟受損，組織腫脹。與模型組相比，硝酸鑭各劑量組肝臟質(zhì)量均有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，硝酸鑭各劑量組小鼠肝臟系數(shù)均有不同程度的降低，其中硝酸鑭E組顯著降低（P＜0.05），降低0.67%，說明一定劑量的硝酸鑭能有效抑制乙醇所致的肝臟腫大。

表3 硝酸鑭對(duì)小鼠肝臟質(zhì)量和肝臟系數(shù)的影響

2.3 硝酸鑭對(duì)小鼠血清ALT和AST的影響 如表4所示，模型組小鼠血清中ALT和AST含量明顯增加，與空白組相比差異極顯著（P＜0.01），表明乙醇所致小鼠肝損傷模型建立成功。經(jīng)硝酸鑭干預(yù)后，各組小鼠ALT相比模型組均有不同程度的改善，其中以硝酸鑭C、E組的效果最好 （P＜0.05 或P＜ 0.01），分別降低 23.58、21.07 U/L，各組小鼠AST相比模型組均有不同程度的改善，其中以硝酸鑭C、D、E組的效果最好 （P＜0.05或P＜0.01），分別降低 52.56、43.83、28.54 U/L，表明硝酸鑭能顯著改善乙醇所致急性肝損傷小鼠的肝功能。

表4 硝酸鑭對(duì)小鼠血清ALT和AST的影響U/L

2.4 硝酸鑭對(duì)小鼠T-SOD活力的影響 如表5所示，與空白組相比，模型組血清和肝臟中TSOD活力極顯著降低（P＜0.01），提示乙醇能降低小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活性。與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預(yù)組T-SOD活力逐漸增強(qiáng)，其中硝酸鑭B、C、D、E組血清中T-SOD活力極顯著增強(qiáng)（P＜ 0.01），分別增加 27.53、38.74、48.01、53.96 U/mL， 硝酸鑭 C、D、E 組肝臟中 TSOD活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05或P＜0.01），分別增加 15.87、18.6、17.78 U/mg prot。

表5 硝酸鑭對(duì)小鼠T-SOD活力的影響

2.5 硝酸鑭對(duì)小鼠GSH含量的影響 如表6所示，與空白組相比，模型組血清GSH含量極顯著降低（P＜0.01），肝臟GSH含量有所降低，但差異不顯著（P＞0.05），提示乙醇能降低小鼠體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量。與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預(yù)組血清GSH含量逐漸升高，且在D、E組中表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05或P＜ 0.01），分別增加 5.94、7.86 μmol/L。 肝臟中GSH含量呈現(xiàn)出和血清GSH含量相似的變化趨勢(shì)，且在硝酸鑭E組中顯著升高 （P＜0.05），增加 0.83 μmol/g prot。

表6 硝酸鑭對(duì)小鼠GSH含量的影響

2.6 硝酸鑭對(duì)小鼠MDA含量的影響 如表7所示，與空白組相比，模型組血清和肝臟中MDA含量顯著增加（P＜0.05），提示乙醇能增加小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的含量。與模型組相比，多數(shù)硝酸鑭干預(yù)組的血清MDA含量表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，且在D、E組中表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），分別降低4.13、4.41 nmol/mL。與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預(yù)組肝臟MDA含量逐漸降低，其中硝酸鑭E組MDA含量顯著降低（P＜0.05），降低 0.64 nmol/mg prot。

表7 硝酸鑭對(duì)小鼠MDA含量的影響

3 討論

ROS是機(jī)體正常代謝過程的產(chǎn)物，線粒體是其重要來源，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基以及一氧化氮等 （Afonso等，2019）。適量的ROS為人體生命活動(dòng)和組織細(xì)胞生長代謝所必需，但過量的ROS會(huì)損傷抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，并降低GSH和SOD；還能導(dǎo)致DNA損傷和線粒體功能障礙（Wang等，2019）。這些改變最終會(huì)導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞凋亡，損傷可發(fā)生在各種臟器，如肝、腎、肺等（Xin 等，2019）。 細(xì)胞內(nèi)超量的過氧化物會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯后修飾異常。乙醇介導(dǎo)的氧化應(yīng)激已被證實(shí)與酒精性肝病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、酒精性胃病和發(fā)育障礙等密切相關(guān)，其分子機(jī)制可能與刺激線粒體產(chǎn)生更多的超氧陰離子和過氧化氫，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化有關(guān)（左瑋等，2018；Altamirano等，2011）。乙醇也可誘導(dǎo)紅細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，在與多不飽和脂肪酸的共同作用下，乙醇在代謝過程中產(chǎn)生的過量自由基會(huì)進(jìn)一步增加，這些超氧基團(tuán)可能通過血液循環(huán)損傷其他器官或組織 （王榮榮等，2019）。

ALT和AST是評(píng)價(jià)肝臟是否受損的兩個(gè)重要的生化指標(biāo)。正常情況下，ALT和AST在血清中的含量較低，而當(dāng)肝臟受損時(shí)，大量ALT和AST釋放入血，引起血清中這兩種酶活性明顯升高，表明肝臟中細(xì)胞滲漏和細(xì)胞膜功能完整性喪失 （Fujiwara等，2013；Neuman 等，2013；Zeng 等，2013；Yan 等，2007；Lin 等，2004）， 其在血液中的水平也是臨床檢驗(yàn)肝功能的重要指標(biāo)之一。本研究中，模型組小鼠血清中ALT和AST活性顯著升高，表明乙醇能造成小鼠的急性肝損傷。與模型組相比，部分硝酸鑭干預(yù)組小鼠血清ALT和AST顯著降低，表明硝酸鑭具有一定的護(hù)肝作用。

SOD能阻止自由基啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化進(jìn)程，是ROS清除過程中發(fā)揮作用的第一種抗氧化酶，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，其活力反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，在清除過氧化氫、超氧陰離子和羥自由基中發(fā)揮關(guān)鍵作用（石敏娟等，2019；Wang等，2019）。本研究中，與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預(yù)組小鼠的T-SOD活力逐漸升高，并在大部分干預(yù)組的血清和肝臟中表現(xiàn)出顯著差異，提示硝酸鑭能通過增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活性而發(fā)揮護(hù)肝作用。

GSH是重要的低分子巰基抗氧化劑，在生物系統(tǒng)中主要以還原形式存在，也是GPX和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的重要輔因子，其功能的發(fā)揮取決于半胱氨酰殘基的硫醇基數(shù)量，與多種外源性和內(nèi)源性氧化劑的解毒有關(guān)，在氧化應(yīng)激中起保護(hù)作用（Adriana 等，2020；Farina 等，2019）。 本研究中，與模型組相比，隨著硝酸鑭劑量的增加，各干預(yù)組小鼠血清和肝臟GSH含量逐漸升高，并在硝酸鑭D、E組中表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表示硝酸鑭可通過增加小鼠體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量而減輕肝損傷。

MDA是不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成的終末產(chǎn)物之一，其含量可以間接反映膜脂質(zhì)氧化的受損程度 （王艷婕等，2019；Gao等，2017）。也有研究表明，ROS和MDA存在劑量反應(yīng)關(guān)系（Chen等，2019）。MDA是肝臟脂質(zhì)過氧化的生物標(biāo)志物（Li等，2015），是間接評(píng)價(jià)保肝藥物療效的生化指標(biāo) （Sreelatha等，2009）。本研究中，與模型組相比，多數(shù)硝酸鑭干預(yù)組的血清和肝臟MDA出現(xiàn)下降，且在部分硝酸鑭干預(yù)組中表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表示硝酸鑭可通過減少脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物的含量而發(fā)揮對(duì)急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。

黃可欣（2003）和李冬梅（2008）等的研究表明，低劑量硝酸鑭能適當(dāng)提高機(jī)體的抗氧化能力，并認(rèn)為稀土的生物學(xué)效應(yīng)與劑量大小有關(guān)，小劑量有刺激作用而大劑量則有抑制作用。劉穎等（2001）研究指出，一定劑量的硝酸鑭可以升高SOD和GPX，降低MDA含量。本研究結(jié)果表明，硝酸鑭能提高乙醇所致急性肝損傷小鼠的抗氧化能力，對(duì)小鼠肝臟存在一定的保護(hù)作用，這與以往的研究結(jié)果一致。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，硝酸鑭能通過降低小鼠血清ALT和AST的活性，提高其體內(nèi)抗氧化酶的活性，清除體內(nèi)自由基和降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物含量而發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用并恢復(fù)肝功能，本試驗(yàn)條件下，最佳保護(hù)作用劑量為1.0 mg/kg和2.0 mg/kg。