大麻素受體2激動劑AM1241對TGF-β1誘導的HSC-T6增殖、活化及凋亡的影響

龍翠珍，舒遠輝，何萍，2，王豫萍，2△

肝纖維化是彌漫性肝損傷后組織修復過程中的代償反應，是各種慢性肝病向肝硬化發展的中間環節［1］。肝纖維化的實質是以膠原為主的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的合成增多而降解不足，并在肝臟過度沉積，此過程中肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化是中心環節［2］。HSCs 存在于竇間隙Disse 腔內，正常情況下HSCs 表現為富含維生素A脂滴的靜止型［3］。在慢性肝損傷的刺激下，HSCs 表型由靜止型轉變為激活型，其特征為表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），分泌與合成ECM，自分泌或旁分泌轉化生長因子（TGF）-β1、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等各種細胞因子，這些細胞因子能夠促進HSCs的活化而加重肝纖維化［4-5］。因此，抑制HSCs 增殖與活化，促進其凋亡已成為當前抗肝纖維化治療的主要策略［6］。

近年研究發現內源性大麻素系統（endocannabinoid system，ECS）在肝纖維化及肝硬化的發生發展中起重要作用，是抗肝纖維化的潛在治療靶點［7］。大麻素受體（cannabinoid receptor ，CB）2是ECS 的重要組成部分之一，具有抗炎、抗氧化應激、抗纖維化等作用［8-9］。本課題組前期研究發現，CB2 受體激動劑AM1241 能減輕四氯化碳（CCl4）誘導的小鼠肝纖維化，降低肝組織血小板衍生因子（platelet derived growth factor，PDGF）蛋白的表達水平，提示激活CB2 可改善肝纖維化［10］。但是有關CB2 受體激動劑AM1241 對體外培養的HSCs 增殖、活化與凋亡的影響鮮有報道。本課題組前期體外實驗采用葡萄糖氧化酶刺激大鼠肝星狀細胞（HSCT6）建立氧化應激模型，發現AM1241能發揮抗氧化作用抑制HSC-T6 的增殖與活化［11］。本研究采用TGF-β1 誘導HSC-T6 活化，進一步探討AM1241 對HSC-T6增殖、活化及凋亡的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自昆明細胞庫；胎牛血清（FBS）購自以色列Biological Industries 公司；高糖DMEM 培養基購自美國GIBCO 公司；重組人TGF-β1 購自美國Peprotech 公司；AM1241 購自美國Selleck 公司；CCK-8 試劑盒購自日本同仁化學研究所；Annexin V FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD 公司；全蛋白提取試劑盒及BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗鼠GAPDH抗體、兔抗鼠α-SMA抗體、兔抗鼠c-Jun氨基末端激酶（JNK）1+JNK2+JNK3 抗體、兔抗鼠JNK1+JNK2+JNK3（磷酸化T183+T183+T221，p-JNK）抗體均購自美國Abcam公司；兔抗鼠bFGF 抗體購自愛必信公司；兔抗鼠Bax 多克隆抗體購自沈陽萬類公司；兔抗鼠cleaved caspase-3 單克隆抗體購自美國CST 公司；山羊抗兔IgG（H+L）HRP 購自杭州聯科生物技術有限公司；ECL 化學發光液購自美國Millipore 公司；ELX800酶標儀、BIO-RAD全套電泳裝置購自美國BIO-RAD公司；Chemi Scope Mini 3300 化學發光成像儀購自上海勤翔科學儀器有限公司；NaviosTM分析型流式細胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HSC-T6 采用含90% 高糖DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素混合液+1%L-谷氨酰胺的培養基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中進行培養，待細胞生長至融合度為70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 CCK-8 法測定AM1241 對HSC-T6 增殖能力的影響 取對數生長期HSC-T6 以4×103個/孔接種于96 孔板內，實驗設空白對照組（空白培養基）、陰性對照組（未加藥品）、TGF-β1組（5 μg/L TGF-β1）及20、40、80、160 μmol/L AM1241組（5 μg/L TGF-β1+20、40、80、160 μmol/L AM1241）；每組設5個復孔，培養24 h。吸掉舊培養基，用含1%FBS 的高糖DMEM 培 養 液 洗1 次，加 入100 μL/孔 含1%FBS 的 高 糖DMEM培養液，再加入10 μL/孔CCK-8試劑，37 ℃、5%CO2孵育1.5 h，采用ELX800 酶標儀于450 nm 波長處檢測吸光度（A）值。計算AM1241 系列濃度梯度對HSC-T6 的生長抑 制 率，細 胞 生 長 抑 制 率=［1-（A藥物-A空白）/（A0-A空白）］×100%，并采用GraphPad Prism 5.0 軟件計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.3 流式細胞術檢測AM1241對HSC-T6凋亡的影響 取對數生長期HSC-T6分為陰性對照組（未加藥品）、TGF-β1組（5 μg/L TGF-β1）及30、60 μmol/L AM1241 組（5 μg/L TGFβ1+30、60 μmol/L AM1241），培養48 h。用不含EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，1 000 r/min離心5 min，PBS洗2次，計數，取2×106個/mL 的細胞懸液100 μL 于流式管內，分別加入5 μL 的Annexin V FITC 和PI，避光孵育15 min，后加入400 μL的緩沖液，于NaviosTM分析型流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot 檢測α-SMA、bFGF、Bax、cleaved caspase-3、p-JNK蛋白的表達 將對數生長期HSC-T6分成陰性對照組（未加藥品）、TGF-β1 組（5 μg/L TGF-β1）和27 μmol/L AM1241 組（5 μg/L TGF-β1+27 μmol/L AM1241）。采用全蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳、轉膜至PVDF 膜、5%脫脂奶粉封閉1.5 h，膜條4 ℃孵育一抗GAPDH 抗體（1∶10 000）、α-SMA抗體（1∶5 000）、bFGF抗體（1∶300）、Bax抗體（1∶500）、cleaved caspase-3 抗體（1∶1 000）、p-JNK 抗體（1∶1 500）、JNK抗體（1∶1 000）過夜，次日洗膜，室溫孵育山羊抗兔IgG（H+L）HRP 1.5 h，洗膜，加入ECL化學發光液顯影并曝光。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算各目的蛋白與內參蛋白GAPDH灰度值的比值。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度AM1241 對TGF-β1 誘導后HSC-T6增殖能力的影響 TGF-β1 組細胞增殖能力與陰性對照組差異無統計學意義；與TGF-β1 組比較，AM1241 可抑制HSC-T6 增殖能力，且隨著AM1241濃度的升高，細胞增殖能力逐漸降低，細胞生長抑制率逐漸升高，組間多重比較差異均有統計學意義，見表1。AM1241的IC50為27 μmol/L。

Tab.1 Effects of different concentrations of AM1241 on the proliferation of HSC-T6 cells表1 實驗各組對HSC-T6增殖能力的影響（n=3）

Tab.1 Effects of different concentrations of AM1241 on the proliferation of HSC-T6 cells表1 實驗各組對HSC-T6增殖能力的影響（n=3）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與陰性對照組比較，c與TGF-β1組比較，d與20 μmol/L AM1241組比較，e與40 μmol/L AM1241組比較，f與80 μmol/L AM1241組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組TGF-β1組20 μmol/L AM1241組40 μmol/L AM1241組80 μmol/L AM1241組160 μmol/L AM1241組F A值0.197±0.008 1.033±0.103a 1.090±0.009a 0.756±0.015abc 0.489±0.015abcd 0.410±0.026abcde 0.353±0.006abcdef 1 827.561＊細胞生長抑制率（%）--0 37.379±1.486c 67.336±1.887cd 76.017±2.293cde 82.041±0.336cdef 713.305＊

2.2 流式細胞術檢測AM1241 對TGF-β1 誘導后HSC-T6 凋亡的影響 陰性對照組、TGF-β1 組及30、60 μmol/L AM1241 組HSC-T6 凋 亡率 分 別 為（7.983±2.129）%、（8.527±2.089）%、（30.973±1.732）%、（59.200±9.224）%，組間比較差異有統計學意義（n=3，F=72.387，P＜0.05）。TGF-β1組細胞凋亡率與陰性對照組比較差異無統計學意義；與TGF-β1 組比較，30、60 μmol/L AM1241 組HSC-T6 凋亡率均明顯上 升，且60 μmol/L AM1241 組 高 于30 μmol/L AM1241組（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Detection of apoptosis by flow cytometry in HSC-T6 cells of each group圖1 流式檢測各組HSC-T6的凋亡情況

2.3 AM1241 對HSC-T6 活化的影響 TGF-β1 組α-SMA 和bFGF 蛋白表達水平較陰性對照組升高（P＜0.05）；27 μmol/L AM1241 組α-SMA 和bFGF 蛋白表達水平較TGF-β1 組明顯降低（P＜0.05），見圖2、表2。

cells of each group圖2 各組HSC-T6 α-SMA和bFGF蛋白表達情況

Tab.2 Comparison of relative expression levels of α-SMA and bFGF proteins in HSC-T6 cells of each group表2 各組HSC-T6 α-SMA和bFGF蛋白表達水平的比較（n=3）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of α-SMA and bFGF proteins in HSC-T6 cells of each group表2 各組HSC-T6 α-SMA和bFGF蛋白表達水平的比較（n=3）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別陰性對照組TGF-β1組27 μmol/L AM1241組F n3 3 3 α-SMA蛋白0.397±0.073 0.763±0.130a 0.150±0.117ab 23.838＊bFGF蛋白0.246±0.096 0.378±0.088a 0.238±0.061ab 4.527＊

2.4 AM1241 對TGF- β1 誘 導 的HSC-T6 Bax、cleaved caspase-3、p-JNK蛋白表達的影響 TGF-β1組Bax、cleaved caspase-3 和p-JNK 蛋白表達水平與陰性對照組差異均無統計學意義（P＞0.05）；27 μmol/L AM1241 組Bax、cleaved caspase-3、p-JNK 蛋白表達水平較TGF-β1 組升高（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.3 Expressions of Bax,cleaved caspase-3 and p-JNK proteins in HSC-T6 cells圖3 各組HSC-T6 Bax、cleaved caspase-3、p-JNK蛋白表達情況

Tab.3 Relative expression levels of Bax,cleaved caspase-3 and p-JNK proteins in HSC-T6 cells表3 各組HSC-T6Bax、cleaved caspase-3和p-JNK蛋白表達水平的比較 （n=3）

Tab.3 Relative expression levels of Bax,cleaved caspase-3 and p-JNK proteins in HSC-T6 cells表3 各組HSC-T6Bax、cleaved caspase-3和p-JNK蛋白表達水平的比較 （n=3）

＊P＜0.05；a與陰性對照組比較，b與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別陰性對照組TGF-β1組27 μmol/L AM1241組F Bax蛋白0.261±0.217 0.245±0.050 0.342±0.020ab 7.327＊cleaved caspase-3蛋白0.548±0.039 0.483±0.074 0.974±0.346ab 6.754＊p-JNK蛋白0.491±0.180 0.587±0.089 0.894±0.049ab 9.316＊

3 討論

肝纖維化是持續性肝損傷后肝內結締組織異常增生的病理生理過程［12］。HSCs 是肝纖維化的主要效應細胞，其活化可促進肝纖維化的發生發展。若能抑制HSCs的活化與增殖，理論上可部分逆轉或者減慢肝纖維化的進展［6，12］。TGF-β1 是目前已知最強的促纖維化細胞因子之一，是激活靜態HSCs的主要因子［5］。鄭素軍等［13］研究顯示，以10 μg/L TGF-β1分別刺激HSC-T6 24、36 h，可增強細胞增殖能力，并上調膠原和α-SMA 蛋白表達水平，提示TGF-β1 可促進HSC-T6 的增殖與活化。本研究結果顯示，以5 μg/L TGF-β1 刺激HSC-T6 24 h 后，其α-SMA 與bFGF 蛋白表達水平較陰性對照組明顯升高，提示TGF-β1可促進HSC-T6活化，滿足本研究對實驗模型的要求。但HSC-T6 增殖能力、細胞凋亡率和凋亡相關蛋白cleaved caspase-3、Bax 蛋白表達水平與陰性對照組無明顯差異，提示TGF-β1對HSC-T6增殖、凋亡均無明顯影響，與鄭素軍等［13］研究結果不同，可能與TGF-β1 濃度及HSC-T6 狀態、生長環境與培養方式不同有關。

內源性大麻素系統由CB、內源性配體及與配體合成、降解相關的酶類共同構成［14］。CB包括CB1和CB2兩種，屬于G蛋白偶聯受體，其中CB1主要分布在中樞神經系統，CB2 主要分布在外周免疫細胞中［10］。有研究發現，在CCl4或乙醇誘導的肝纖維化動物模型中，拮抗CB2可加重肝纖維化，激活CB2可有效抑制肝纖維化［15］。本研究結果顯示，CB2 受體激動劑AM1241可抑制TGF-β1誘導的HSC-T6的增殖能力，且呈劑量依賴性，提示激活CB2可抑制體外培養的HSC-T6增殖，與張自力等［16］研究結果一致。α-SMA、bFGF表達水平可反映HSCs細胞活化程度。本研究結果顯示，AM1241可明顯下調TGF-β1誘導的HSC-T6 α-SMA、bFGF 蛋 白 表 達 水平，提示AM1241可有效抑制TGF-β1誘導的HSC-T6的活化及相關細胞因子的分泌，也證實激活CB2 可產生抗肝纖維化的作用。

目前AM1241 對活化的HSCs 凋亡的影響及其機制鮮有報道。有研究顯示，在肝纖維化動物模型中，CB 可能參與HSCs 內絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的調控［16-17］。JNK 是MAPK 的家族成員之一，參與調節炎癥反應及細胞分化、增殖、凋亡等多種生物學過程［18］。JNK通路的促凋亡作用依賴于c-fos、c-Jun等細胞核轉錄因子的活化，活化的c-fos、c-Jun又可調控Bax、Bcl-2 等多種凋亡基因的表達，進而促進細胞凋亡的發生［19-20］。Bax 和Bcl-2 基因的表達產物均定位于線粒體膜，Bax 增加細胞色素C 的釋放，Bcl-2抑制細胞色素C的釋放，從線粒體釋放的細胞色素C 能促進caspase-3 裂解并啟動細胞凋亡［21］。caspase-3是凋亡過程的主要效應因子，其活化標志著凋亡進入不可逆階段［22］。本研究結果顯示，與TGF-β1 組比較，30、60 μmol/L AM1241 組HSC-T6凋亡率均明顯上升，且60 μmol/L AM1241組高于30 μmol/L AM1241組；Western blot結果顯示，27 μmol/L AM1241 組HSC-T6 Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達水平較TGF-β1 組升高，提示AM1241 可促進HSCT6 凋亡。同時，27 μmol/L AM1241 組HSC-T6 p-JNK 蛋白表達水平較TGF-β1 組明顯上調，提示AM1241 對HSC-T6 的促凋亡作用可能與JNK 通路相關。

綜上所述，CB2 受體激動劑AM1241 可抑制TGF-β1 誘導的HSC-T6 增殖與活化，促進HSC-T6凋亡，且其作用機制可能與JNK通路有關。