巨噬細胞極化對心肌成纖維細胞活化的影響

吳惠娟，張盛昔，楊瀟，胡因銘，王樂旬△，郭姣

《中國心血管病報告2018》顯示我國心血管病現患人數約為2.9 億，其中90%以上與心臟有關［1］。心肌纖維化是眾多心臟疾病的共同病理改變，其持續進展會嚴重影響患者的生存和預后［2］。預防和逆轉心肌纖維化是心血管疾病防治的主要目標，但目前臨床上仍缺乏有效防治心肌纖維化的藥物［3］。心肌成纖維細胞的異常活化是心肌纖維化的核心環節［4］。巨噬細胞在不同條件刺激下可極化為經典活化的巨噬細胞（M1 型）或選擇性活化的巨噬細胞（M2 型）［5］。研究顯示不同型別的巨噬細胞在心肌纖維化發生發展中的作用并不一致，可表現為抑制［6-7］和促進［8-10］心肌纖維化的雙重作用。本研究通過體外實驗以明確不同型別巨噬細胞在原代心肌成纖維細胞活化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級SD 雄性大鼠10 只，體質量150 g 左右，購自廣東省醫學實驗動物中心。重組大鼠巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、白細胞介素（IL）-4和干擾素（INF）-γ購自美國PeproTech 公司，血小板衍生生長因子受體（PDGFR）α、磷酸化（p）-PDGFRα（Tyr720）、PDGFRβ、p-PDGFRβ（Tyr751）、膠原蛋白1（Col1a1）和平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體購自英國Abcam 公司，結締組織生長因子2（CCN2）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公 司，GAPDH 抗 體 購 自 美 國ProteinTech 公司，Smad2 和p-Smad2（Ser465/Ser467）抗體購自美國Cell Signaling Technology。Leica DMi8 倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司，PikoReal實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qPCR）儀和NanoDrop 2000 核酸濃度測定儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，Mithras LB-940 酶標儀購自德國Berthold公司。

1.2 方法

1.2.1 不同型別巨噬細胞的誘導及鑒定 斷頸處死大鼠后，收集股骨和脛骨。用注射器吸取含1%雙抗的RPMI-1640培養基，插入骨髓腔沖洗，收集沖洗液以提取骨髓細胞。1 000 r/min 室溫離心5 min，棄上清后加入紅細胞裂解液，靜置3～5 min后離心。用含1%雙抗、10%胎牛血清（FBS）以及10 μg/L M-CSF的RPMI-1640培養基重懸細胞，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，隔天換成含10 μg/L M-CSF 和10%FBS 的DMEM培養基。M-CSF 誘導7 d 后，用2 g/L 的乙二胺四乙酸（EDTA）消化細胞，1 000 r/min 離心5 min，加入不含血清的DMEM 培養基重懸細胞并計數。按1.0×106細胞/孔進行接種，6～8 h細胞貼壁后，按照巨噬細胞體外誘導的方法加入刺激因子［5］。M0（無刺激因子）、M1［加入100 μg/L 脂多糖（LPS）+10 μg/L INF-γ］、M2（加入20 μg/L IL-4）。繼續培養12 h后收集培養上清并提取細胞mRNA，用于后續實驗。通過qPCR 鑒定不同型別巨噬細胞表型特征分子的表達，其中誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和IL-12為M1型巨噬細胞的特異性標志物［11］，精氨酸酶1（Arg1）和甘露糖受體（CD206）為M2型巨噬細胞的特異性標志物［5］。

1.2.2 心肌成纖維細胞的分離和培養 參照文獻［12］，10只大鼠斷頸處死后，在無菌環境下取出心臟。用含1%雙抗的PBS沖洗3～5次，去掉心房及多余組織，將心臟剪碎成1 mm×1 mm×1 mm 小塊，用PBS 洗3次。將心臟組織吸入無菌錐形瓶中，加入0.1%的膠原酶Ⅱ于37 ℃恒溫水浴中攪拌10～15 min，重復5～8次至消化完全。收集消化后的懸液過濾至15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，PBS清洗1次。加入紅細胞裂解液5 mL，混勻，靜置3 min 后離心，用含20%FBS 的DMEM 重懸細胞，差速貼壁法培養1.5 h后換液，保留貼壁細胞（即心肌成纖維細胞）。取3～5代的細胞用于實驗。

1.2.3 細胞共培養及分組 共培養處理：按照每種細胞1.0×105/孔將巨噬細胞和心肌成纖維細胞分別接種在上方的共培養小室和下方的培養孔中，分別設空白對照組（NT 組，心肌成纖維細胞）、M0組（M0型巨噬細胞與心肌成纖維細胞）、M1組（M1型巨噬細胞與心肌成纖維細胞）、M2組（M2型巨噬細胞與心肌成纖維細胞）。上清處理：將收集到的巨噬細胞上清加入心肌成纖維細胞的培養孔中，每孔1.5 mL，細胞分組與共培養處理一致。培養12 h 后收集心肌成纖維細胞提取mRNA和蛋白，用于后續檢測。

1.2.4 mRNA提取及qPCR檢測巨噬細胞和成纖維細胞特征分子的表達 使用RNAiso Plus提取細胞總RNA［13］。按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。qPCR 反應程序如下：95 ℃3 min；95 ℃30 s，60 ℃15 s，40個循環。GAPDH作為內參，將所得Ct 值按2-ΔΔCt法進行數據處理。引物由上海Invitrogen公司合成，序列見表1。

1.2.5 Western blot 檢測各組細胞纖維化相關蛋白的表達 收集處理過的細胞，加入蛋白裂解液提取蛋白質，并用BCA 法進行蛋白定量。取30 mg 蛋白進行電泳，經濕轉法將凝膠中的蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用5%BSA封閉1 h，4 ℃孵 育 α -SMA、CCN2、PDGFRα、p-PDGFRα（Tyr720）、PDGFRβ、p-PDGFRβ（Tyr751）、Smad2、p-Smad2 和GAPDH一抗（均為1∶1 000稀釋）孵育過夜，洗膜5 min×3次。室溫孵育HRP標記的二抗（1∶10 000稀釋）1 h，洗膜4次后用ECL發光液檢測信號并計算各目的蛋白的相對表達量。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 細胞免疫熒光 將已制備好的細胞爬片用PBS浸洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，0.5%的Triton X-100 室溫通透20 min，PBS浸洗后滴加山羊血清封閉30 min。棄去PBS，滴加Col1a1 和α-SMA 一抗（1∶100 稀釋）并放入濕盒中，4 ℃孵育過夜。PBS浸洗爬片3次，每次3 min，滴加熒光二抗（1∶1 000稀釋），37 ℃孵育1 h。PBS浸洗爬片3次，滴加DAPI避光孵育5 min，PBS清洗后用吸水紙吸干液體。加入抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下采集圖像，觀察Col1a1和α-SMA的表達。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同型別巨噬細胞的誘導及鑒定結果 與M0型相比，M1型巨噬細胞iNOS和IL-12的mRNA水平顯著升高，M2 型中Arg1 和CD206 的mRNA 水平顯著升高（P＜0.05），提示M1型和M2型巨噬細胞誘導成功，見表2。

Tab.2 Determination of different subtypes of macrophages表2 不同型別巨噬細胞的鑒定（n=3）

Tab.2 Determination of different subtypes of macrophages表2 不同型別巨噬細胞的鑒定（n=3）

＊＊P＜0.01；a與M0型相比，b與M1型相比，P＜0.05

型別M0型M1型M2型F iNOS mRNA 1.00±0.17 86.03±2.85a 0.84±0.10b 2661.143＊＊IL-12 mRNA 1.00±0.25 21.48±1.66a 1.42±0.35b 419.207＊＊Arg1 mRNA 1.00±0.20 0.68±0.08 9.82±1.39ab 122.511＊＊CD206 mRNA 1.00±0.13 0.87±0.27 20.26±1.83ab 326.724＊＊

2.2 巨噬細胞共培養后心肌成纖維細胞Col1a1 和α-SMA 的表達變化 熒光顯微鏡下可見，與NT 組相比，M0 組Col1a1 和α-SMA 表達增多；而與M0 組相比，M1 組中Col1a1 和α-SMA 少量表達；而M2 型巨噬細胞共培養的心肌成纖維細胞中Col1a1 和α-SMA大量表達，見圖1。

Fig.1 The activation of cardiac fibroblastsco-cultured with macrophages(immunofluorescence,×200)圖1 巨噬細胞共培養對心肌成纖維細胞活化的影響（免疫熒光，×200）

2.3 不同型別巨噬細胞培養上清對心肌成纖維細胞的影響 巨噬細胞上清處理后心肌成纖維細胞顯示了和巨噬細胞共培養類似的情況。與NT組和M0組相比，M1 組中Col1a1 和α-SMA 少量表達，而M2組中Col1a1和α-SMA大量表達，見圖2。

Fig.2 Effects of macrophage supernatant on cardiac fibroblasts(immunofluorescence,×200)圖2 巨噬細胞上清對心肌成纖維細胞的影響（免疫熒光，×200）

2.4 不同型別巨噬細胞上清對心肌成纖維細胞纖維化相關基因表達的影響 與M0 組相比，M1 組Col1a1 和Col3a1 的mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），而在M2 組中則顯著升高（P＜0.05），見表3。與M0組相比，M1 組中α-SMA 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），而M2 組中α-SMA 和CCN2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），見表3、圖3。

Tab.3 Effects of macrophage supernatants on fibrotic genes in cardiac fibroblasts表3 巨噬細胞上清對心肌成纖維細胞纖維化相關基因表達的影響 （n=3）

Tab.3 Effects of macrophage supernatants on fibrotic genes in cardiac fibroblasts表3 巨噬細胞上清對心肌成纖維細胞纖維化相關基因表達的影響 （n=3）

＊＊P＜0.01；a與NT組相比，b與M0組相比，c與M1組相比，P＜0.05

組別NT組M0組M1組M2組F蛋白水平α-SMA/GAPDH CCN2/GAPDH 0.10±0.01 0.12±0.02 0.15±0.01a 0.26±0.02abc 53.843＊＊mRNA水平Col1a1 1.00±0.05 1.10±0.15 0.70±0.10ab 1.49±0.17abc 20.592＊＊Col3a1 1.00±0.16 1.29±0.14 0.67±0.08ab 2.03±0.26abc 33.754＊＊0.76±0.12 0.97±0.09 0.47±0.10ab 1.33±0.16abc 28.681＊＊

Fig.3 Effects of macrophage supernatants on fibrotic genes in cardiac fibroblasts圖3 巨噬細胞上清對心肌成纖維細胞纖維化相關基因表達的影響

2.5 不同型別巨噬細胞上清對心肌纖維化相關通路分子表達的影響 4 組細胞TGFβRⅡ和PDGFRα的mRNA 水平比較差異無統計學意義，PDGFRα 和TGFβRⅡ通路關鍵分子Smad2的總蛋白及磷酸化水平沒有明顯改變。與NT 組和M0 組相比，M1 組PDGFRβ 的mRNA 和蛋白磷酸化水平顯著降低，而其蛋白磷酸化水平在M2 組中則明顯升高（P＜0.05），見圖4、表4。

Fig.4 Effects of macrophage supernatants on fibrotic signaling pathways in cardiac fibroblasts圖4 巨噬細胞上清對心肌成纖維細胞纖維化通路的影響

Tab.4 Effects of macrophage supernatants on fibrotic signaling pathways in cardiac fibroblasts表4 巨噬細胞上清對心肌成纖維細胞纖維化通路的影響（n=3）

Tab.4 Effects of macrophage supernatants on fibrotic signaling pathways in cardiac fibroblasts表4 巨噬細胞上清對心肌成纖維細胞纖維化通路的影響（n=3）

＊＊P＜0.01；a與NT組相比，b與M0組相比，c與M1組相比，P＜0.05

3 討論

心肌纖維化幾乎與所有的心臟疾病都有關聯，心肌梗死、心臟外科手術、高血壓、心肌病、毒性因子（乙醇和蒽環類藥物）、代謝紊亂（糖尿病和肥胖）以及高齡等都能促進心肌纖維化的發生和發展［14］，因此至今仍缺乏有效的防治措施阻止和逆轉心肌纖維化。在本研究中，筆者通過體外的細胞實驗證實不同型別巨噬細胞對心肌成纖維細胞的活化有不同的影響，其中M1型巨噬細胞上清能夠抑制心肌成纖維細胞的活化，而M2型上清能夠促進其活化。

目前不同型別巨噬細胞的區別在于：一是刺激物的不同，M1 型巨噬細胞的刺激因子是LPS，M2 型巨噬細胞的刺激因子是IL-4；二是表達的蛋白因子不同，M1型巨噬細胞特異性表達CXC類趨化因子配體9（CXCL9）、iNOS、IL-12、CD80和TNF-α，M2型細胞可特異性表達CD206、Arg1、TGF-β和IL-10等［5］。筆者選擇了iNOS 和IL-12 作為M1 型的標記，選擇CD206 和Arg1 作為M2 型巨噬細胞的標記，證實這些標記能夠反映各自的型別，表明M1 和M2 型巨噬細胞誘導成功。

目前不同型別巨噬細胞的具體作用仍有分歧。有研究顯示M2 型巨噬細胞的浸潤能夠促進心肌纖維化的發生和發展，在血管緊張素Ⅱ誘導的心肌纖維化動物模型中，M2型巨噬細胞在纖維化的心臟組織中聚集，促進成纖維細胞的活化和膠原的合成與分泌［16］。在基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）敲除的小鼠心肌梗死模型以及衰老的小鼠模型中也證實了類似的結果［10］。在IL-13 敲除的小鼠心肌梗死模型中，M2 型巨噬細胞在損傷的心臟組織中減少，心肌纖維化程度增加，心功能惡化［8］。在清道夫受體A（SR-A）敲除的心肌梗死模型、主動脈縮窄所致的心肌纖維化模型以及糖尿病心肌病模型中也觀察到類似的結果［7，17-18］。同樣，M1型巨噬細胞也有和M2類似的報道，即有些研究顯示M1型巨噬細胞能夠促進心肌纖維化的發生［9］，而有些報道認為M1型能夠抑制心肌纖維化的發生發展［6-7］。M1型巨噬細胞出現在損傷的早期，主要起到誘導炎癥發生發展的作用，而M2型巨噬細胞的高峰出現在損傷的后期，主要發揮組織修復的作用［19］。筆者推測在這些動物模型中，并不是單一型別的巨噬細胞，而是M1和M2型巨噬細胞所占比例不同所致。

纖維化的發生過程中，TGF-β1 介導的TGFβRs通路和PDGFs介導的PDGFRs通路發揮了重要的作用［20-21］。本研究發現TGFβR 通路下游Smad2 和PDGFRs 通路中PDGFRα 蛋白活性變化不明顯，而是顯著影響了PDGFRβ的轉錄、翻譯及磷酸化水平，提示不同型別巨噬細胞對纖維化的影響主要是通過PDGFRβ 信號通路來發揮作用的。值得注意的是，體外分離培養的心肌成纖維細胞在培養的過程中會發生活化，這可能和培養環境與在體環境不同有關［22］。因此，本研究并沒有設置纖維化陽性組對照（比如利用TGF-β1或PDGFs進行處理）以及在陽性處理的基礎上利用不同型別巨噬細胞上清處理。

綜上所述，本研究的結果表明不同型別巨噬細胞對心肌成纖維細胞的活化有不同的影響，M2型巨噬細胞的上清能夠促進心肌成纖維細胞的活化，而M1型上清則能抑制其活化，這可能與調控PDGFRβ通路的活化有關。本研究只是在體外對巨噬細胞影響心肌成纖維細胞的活化進行了探討，并沒有明確上清的具體成分以及探討不同型別巨噬細胞在動物體內對心肌纖維化的影響，這是今后的研究方向。