非酒精性脂肪性肝炎大鼠TLR4基因及其甲基化水平的相關(guān)性研究

徐慧超，高艷，孟雅楠，陳浩，郝健亨，劉晉芳，劉楊，苗宇船

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是 一 種 與胰島素 抵 抗（insulin resistance，IR）和遺傳易感性有關(guān)的代謝性肝病，在病理上可分為非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化和肝硬化［1-2］。NASH 以肝細(xì)胞脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞氣球樣變?yōu)樘攸c(diǎn)，是NAFLD進(jìn)程中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，可加速疾病后續(xù)的發(fā)展［3］。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是TLR 家族中識(shí)別病原微生物的重要成員，是介導(dǎo)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）應(yīng)答最主要的受體，該受體水平的表達(dá)不僅在固有免疫和IR 之間起到紐帶作用，也在NASH 的肝臟損傷及修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用［4-5］。但目前尚缺乏對(duì)NASH 大鼠模型肝臟組織中TLR4基因甲基化水平的研究報(bào)道。本文以SD大鼠為研究對(duì)象，探討肝臟中TLR4基因表達(dá)與其甲基化水平的相關(guān)性，為NASH的臨床研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠20只，SPF級(jí)，體質(zhì)量180～230 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。大鼠在室溫（23±2）℃、30%～40%相對(duì)濕度、每天12 h 光照/黑暗環(huán)境下飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物管理與使用委員會(huì)相關(guān)指導(dǎo)原則。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組與模型組，每組10只。正常組給予普通飲食，模型組給予高脂高糖飲食（68.6%基礎(chǔ)飼料、20%豬油、10%蔗糖、1%膽固醇、0.2%膽酸、0.2%丙硫氧嘧啶，30%果糖溶液），于24周后處死，測(cè)量大鼠體質(zhì)量及肝質(zhì)量，并取各組大鼠血清及肝臟組織，于低溫保存。肝指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。收集血清及肝臟組織凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器 HE染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；CD68、TLR4、β-actin 兔抗鼠單克隆抗體，羊抗兔IgG均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；SP（小鼠/兔IgG）-POD KIT 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRPremix Ex Taq購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。熒光顯微鏡（Leica）；MK3型酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo公司）；凝膠電泳儀、電泳槽、凝膠成像分析儀、基因擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Bio-rad）；常溫離心機(jī)（Eppendorf）；超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo）。

1.3 血清指標(biāo)檢測(cè) 取正常組與模型組大鼠血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)大鼠血清ALT、AST、TG 及TC水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 肝臟組織病理學(xué)切片 取大鼠肝臟組織，進(jìn)行組織觀察并制備5 μm 冰凍切片，HE 染色后，觀察各組大鼠肝細(xì)胞的形態(tài)變化、脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況。

1.5 免疫組化染色法檢測(cè)肝臟CD68 蛋白的表達(dá) 制備大鼠肝臟5 μm冰凍切片，加入CD68（巨噬細(xì)胞分子標(biāo)記物）一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗，室溫孵育1 h后，加入DAB 顯色，并用蘇木素復(fù)染1 min，最后中性樹(shù)膠封片。在200 倍光鏡下，每組取5 張切片，每張隨機(jī)讀取5 個(gè)視野。CD68表達(dá)陽(yáng)性為光鏡下細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western blotting，WB）檢測(cè)肝臟TLR4蛋白含量 取肝臟組織200 mg，研磨成組織勻漿，加入適量含有PMSF 的蛋白裂解液，提取組織蛋白，并用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣本上樣進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后封閉、加入內(nèi)參及TLR4 一抗（1∶1 000）孵育，4 ℃過(guò)夜，洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，充分洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。采用IPP 6.0 軟件計(jì)算TLR4 與β-actin 條帶灰度值的比值，作為其各自的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)肝臟TLR4 mRNA 含量 于液氮中研磨大鼠肝臟組織，Trizol法提取總RNA，通過(guò)超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的純度及濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書獲取cDNA，以cDNA 為模板，β-actin 為內(nèi)參，用SYBR法檢測(cè)TLR4 mRNA的表達(dá)。引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。以2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

Tab.1 The primer sequence of TLR4 and β-actin表1 RT-PCR引物序列

1.8 亞硫酸氫測(cè)序PCR（bisulphite sequencing PCR，BSP）法檢測(cè)肝臟TLR4 基因甲基化水平 在Ensemble 網(wǎng)站上檢索TLR4 基因的啟動(dòng)子區(qū)域（http：//genome.ucsc.edu/）。應(yīng)用MethPrimer 程 序（http：//www.urogene.org/methprimer）預(yù) 測(cè)TLR4 基因內(nèi)CpG 島的特定甲基化位置。TLR4 基因片段中含有4個(gè)CpG位點(diǎn)，在序列中的位置已在圖1中加粗標(biāo)記，分別為24、134、224、229。將各組大鼠肝臟組織送往上海生工生物工程股份有限公司完成BSP檢測(cè)。BSP擴(kuò)增引物序列見(jiàn)圖1，其中帶框?yàn)樵O(shè)計(jì)的引物位置，中間部分為待測(cè)序列。

Fig.1 BSP amplification primers and CpG sites in the TLR4 gene fragment圖1 BSP擴(kuò)增引物及TLR4基因片段中CpG位點(diǎn)

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟表面及切片觀察 肉眼觀察，正常組大鼠肝臟顏色偏深紅色，肝臟大小、形態(tài)如常，包膜光滑清晰，肝緣角較銳；實(shí)驗(yàn)24 周末模型組大鼠肝臟顏色淡黃，肝臟偏大，形態(tài)飽滿，肝緣角變鈍，見(jiàn)圖2。顯微鏡下觀察HE染色的肝臟切片可發(fā)現(xiàn)，正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈放射狀排列。與正常組相比，模型組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)不明顯，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴，且肝臟內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，見(jiàn)圖3。

Fig.2 Pictures showing liver surface of normal group and model group圖2 正常組與模型組肝臟表面觀察

Fig.3 HE staining of normal group and model group(×100)圖3 正常組與模型組HE染色（×100）

2.2 2組大鼠肝臟指數(shù)及血液檢測(cè)指標(biāo) 與正常組相比，模型組大鼠肝指數(shù)顯著升高，血清中ALT、AST、TC 及TG 水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 2 組大鼠肝臟中CD68 蛋白的表達(dá) 與正常組相比，模型組棕黃色區(qū)域顯著增加，肝臟中CD68 蛋白表達(dá)明顯升高，見(jiàn)圖4。

Tab.2 Blood test indicators of normal group and model group表2 正常組與模型組大鼠血液檢測(cè)指標(biāo) （n=10）

Tab.2 Blood test indicators of normal group and model group表2 正常組與模型組大鼠血液檢測(cè)指標(biāo) （n=10）

＊＊P＜0.01

Fig.4 Pictures showing expressions of CD68 protein in liver of normal group and model group(×200)圖4 正常組與模型組肝臟CD68蛋白的表達(dá)（×200）

2.4 2 組大鼠肝臟中TLR4 蛋白及其mRNA 表達(dá)水平比較 與正常組相比，模型組中TLR4蛋白含量及其mRNA 相對(duì)含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表3，圖5。

Tab.3 Comparison of expressions of relative content of TLR4 protein,TLR4 mRNA and TLR4 gene methylation rates in normal and model rats表3 正常組與模型組大鼠肝臟TLR4蛋白、mRNA表達(dá)及TLR4基因甲基化率比較 （n=10）

Tab.3 Comparison of expressions of relative content of TLR4 protein,TLR4 mRNA and TLR4 gene methylation rates in normal and model rats表3 正常組與模型組大鼠肝臟TLR4蛋白、mRNA表達(dá)及TLR4基因甲基化率比較 （n=10）

＊＊P＜0.01

組別正常組模型組t TLR4蛋白表達(dá)0.03±0.01 0.16±0.02 17.253＊＊TLR4 mRNA表達(dá)1.03±0.10 2.01±0.17 19.741＊＊TLR4基因甲基化率（%）82.76±4.61 55.28±6.08 12.311＊＊

Fig.5 Expressions of relative content of TLR4 protein in liver of normal group and model group圖5 正常組與模型組肝臟TLR4蛋白相對(duì)含量的表達(dá)

2.5 2 組大鼠TLR4 基因甲基化水平比較 BSP 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠4個(gè)甲基化位點(diǎn)中24、134、224及229號(hào)甲基化位點(diǎn)甲基化率下降，總甲基化率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖6、7，表3。

Fig.6 Methylation rate of TLR4 gene of rat liver圖6 大鼠肝臟TLR4基因甲基化率

Fig.7 Methylation rates of 4 methylation sites in normal and model groups圖7 正常組與模型組4個(gè)甲基化位點(diǎn)的甲基化率

2.6 TLR4 基因與甲基化水平的相關(guān)性分析 通過(guò)對(duì)TLR4 mRNA 相對(duì)含量與甲基化程度的相關(guān)性分析顯示，TLR4的甲基化水平與其mRNA相對(duì)含量的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），見(jiàn)圖8。

3 討論

Fig.8 Correlation analysis between TLR4 gene and methylation level圖8 TLR4基因與甲基化水平的相關(guān)性分析

NAFLD 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，最經(jīng)典的學(xué)說(shuō)是Day 和James 提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)［6］。初次打擊主要為IR、脂質(zhì)代謝異常和肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積。第二次“打擊”主要包括反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物增多，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體功能障礙以及肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變和壞死性炎癥［7］。最新研究表明，“二次打擊”尚不足以描述NAFLD相關(guān)聯(lián)的多種致病途徑，而遺傳因素、脂質(zhì)代謝紊亂、IR 及炎癥、氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞脂肪變性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及腸道菌群失調(diào)等“多重平行打擊”可能是引起NAFLD 的重要原因，其中遺傳因素及炎癥的產(chǎn)生在NASH發(fā)病階段起到重要致病作用［8］。

NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展受遺傳基因的調(diào)節(jié)。其中表觀遺傳學(xué)DNA甲基化的變化在NASH發(fā)病遺傳因素中發(fā)揮重要作用。營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、運(yùn)動(dòng)量過(guò)少、壓力過(guò)大等不健康的生活方式皆可影響DNA 甲基化水平的變化。一項(xiàng)23 例單純性脂肪肝患者及22 例NASH 患者參加的研究表明，與單純性脂肪肝患者相比，NASH患者體內(nèi)線粒體編碼的NADH脫氫酶6（NADH dehydrogenase 6，MT-ND6）基因甲基化水平顯著升高，且與NAFLD 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示線粒體基因的DNA 甲基化水平在NAFLD 的發(fā)展和發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用［9］。NAFLD患者肝臟中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）的表觀遺傳修飾有助于IR 恢復(fù)，同時(shí)肝臟PPARγ 共激活因子1α 和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A 的甲基化水平皆與空腹胰島素和IR 穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估相關(guān)［10］。雖然DNA 甲基化水平變化在NAFLD 線粒體功能障礙及胰島素抵抗等方面已被證實(shí)發(fā)揮了重要作用，但DNA 甲基化與TLR4 的相關(guān)研究在NASH 中還鮮見(jiàn)報(bào)道，故本研究從經(jīng)典的炎癥相關(guān)蛋白TLR4 出發(fā)，探討NASH 中TLR4 的表達(dá)與其甲基化水平的相關(guān)性。

TLR4由許多免疫和非免疫細(xì)胞表達(dá)，與機(jī)體的損傷和感染信號(hào)的識(shí)別及轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，在組織損傷、感染和炎癥中起到了“橋梁”作用。研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝小鼠中，富半胱氨酸 蛋 白61（cysteine-rich angiogenic inducer 61，CCN1）蛋白通過(guò)TLR4/MyD88/AP-1 信號(hào)通路升高明顯，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的進(jìn)展［11］。本課題組前期通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NASH 模型大鼠LPS、腫瘤壞死因子、TLR4、β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR domain containing adaptor protein inducing interferonβ，TRIF）表達(dá)明顯升高，出現(xiàn)腸源性內(nèi)毒素血癥，大量IR 的觸發(fā)因子LPS 促使TLR4 表達(dá)升高，進(jìn)而使下游蛋白TRIF 表達(dá)升高，激活核內(nèi)基因，產(chǎn)生大量炎性因子，表明LPS-TLR4-TRIF通路產(chǎn)生炎性因子貫穿于NASH 發(fā)病始終［12-13］。CD68 主要表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞的胞漿蛋白，是巨噬細(xì)胞可靠的標(biāo)記物［14］。通過(guò)觀察各組大鼠切片中CD68的表達(dá)情況，可明顯觀察到巨噬細(xì)胞的變化，使得各組大鼠肝臟組織中TLR4蛋白的表達(dá)得到驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中，模型組CD68表達(dá)顯著高于正常組，表明模型組中巨噬細(xì)胞含量增加，與TLR4的表達(dá)相一致。

本實(shí)驗(yàn)從表觀遺傳學(xué)角度探討TLR4 基因甲基化水平在NASH 大鼠模型中表達(dá)含量的變化，結(jié)果表明，在NASH 發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，TLR4 基因的高表達(dá)可能與其甲基化水平的降低有關(guān)。本研究有望為NASH的臨床研究提供新思路和新方向。