非酒精性脂肪性肝炎大鼠TLR4基因及其甲基化水平的相關性研究

徐慧超，高艷，孟雅楠，陳浩，郝健亨，劉晉芳，劉楊，苗宇船

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是 一 種 與胰島素 抵 抗（insulin resistance，IR）和遺傳易感性有關的代謝性肝病，在病理上可分為非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化和肝硬化［1-2］。NASH 以肝細胞脂肪變性、炎細胞浸潤及肝細胞氣球樣變為特點，是NAFLD進程中一個重要的轉折點，可加速疾病后續的發展［3］。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是TLR 家族中識別病原微生物的重要成員，是介導脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）應答最主要的受體，該受體水平的表達不僅在固有免疫和IR 之間起到紐帶作用，也在NASH 的肝臟損傷及修復方面發揮著重要作用［4-5］。但目前尚缺乏對NASH 大鼠模型肝臟組織中TLR4基因甲基化水平的研究報道。本文以SD大鼠為研究對象，探討肝臟中TLR4基因表達與其甲基化水平的相關性，為NASH的臨床研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠20只，SPF級，體質量180～230 g，購自北京維通利華實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠在室溫（23±2）℃、30%～40%相對濕度、每天12 h 光照/黑暗環境下飼養。本實驗符合動物管理與使用委員會相關指導原則。大鼠適應性喂養1 周后，采用隨機數字表法分為正常組與模型組，每組10只。正常組給予普通飲食，模型組給予高脂高糖飲食（68.6%基礎飼料、20%豬油、10%蔗糖、1%膽固醇、0.2%膽酸、0.2%丙硫氧嘧啶，30%果糖溶液），于24周后處死，測量大鼠體質量及肝質量，并取各組大鼠血清及肝臟組織，于低溫保存。肝指數=肝濕質量/體質量×100%。收集血清及肝臟組織凍存備用。

1.2 主要試劑與儀器 HE染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；CD68、TLR4、β-actin 兔抗鼠單克隆抗體，羊抗兔IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司；SP（小鼠/兔IgG）-POD KIT 購自北京索萊寶科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRPremix Ex Taq購自寶生物工程（大連）有限公司。熒光顯微鏡（Leica）；MK3型酶標儀（芬蘭Thermo公司）；凝膠電泳儀、電泳槽、凝膠成像分析儀、基因擴增儀、實時定量PCR 儀（Bio-rad）；常溫離心機（Eppendorf）；超微量紫外分光光度計（Thermo）。

1.3 血清指標檢測 取正常組與模型組大鼠血清，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測大鼠血清ALT、AST、TG 及TC水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 肝臟組織病理學切片 取大鼠肝臟組織，進行組織觀察并制備5 μm 冰凍切片，HE 染色后，觀察各組大鼠肝細胞的形態變化、脂肪變性及炎性細胞浸潤的情況。

1.5 免疫組化染色法檢測肝臟CD68 蛋白的表達 制備大鼠肝臟5 μm冰凍切片，加入CD68（巨噬細胞分子標記物）一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1 h后，加入DAB 顯色，并用蘇木素復染1 min，最后中性樹膠封片。在200 倍光鏡下，每組取5 張切片，每張隨機讀取5 個視野。CD68表達陽性為光鏡下細胞膜呈棕黃色顆粒。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western blotting，WB）檢測肝臟TLR4蛋白含量 取肝臟組織200 mg，研磨成組織勻漿，加入適量含有PMSF 的蛋白裂解液，提取組織蛋白，并用BCA 法進行蛋白定量。將蛋白樣本上樣進行凝膠電泳，電轉移至PVDF膜后封閉、加入內參及TLR4 一抗（1∶1 000）孵育，4 ℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，充分洗滌后進行化學發光顯影。采用IPP 6.0 軟件計算TLR4 與β-actin 條帶灰度值的比值，作為其各自的相對表達量。

1.7 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測肝臟TLR4 mRNA 含量 于液氮中研磨大鼠肝臟組織，Trizol法提取總RNA，通過超微量紫外分光光度計檢測RNA 的純度及濃度。按照逆轉錄試劑盒說明書獲取cDNA，以cDNA 為模板，β-actin 為內參，用SYBR法檢測TLR4 mRNA的表達。引物購自上海生工生物工程股份有限公司，序列見表1。PCR反應條件為：預變性95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共計40個循環。每個樣本至少重復3次。以2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

Tab.1 The primer sequence of TLR4 and β-actin表1 RT-PCR引物序列

1.8 亞硫酸氫測序PCR（bisulphite sequencing PCR，BSP）法檢測肝臟TLR4 基因甲基化水平 在Ensemble 網站上檢索TLR4 基因的啟動子區域（http：//genome.ucsc.edu/）。應用MethPrimer 程 序（http：//www.urogene.org/methprimer）預 測TLR4 基因內CpG 島的特定甲基化位置。TLR4 基因片段中含有4個CpG位點，在序列中的位置已在圖1中加粗標記，分別為24、134、224、229。將各組大鼠肝臟組織送往上海生工生物工程股份有限公司完成BSP檢測。BSP擴增引物序列見圖1，其中帶框為設計的引物位置，中間部分為待測序列。

Fig.1 BSP amplification primers and CpG sites in the TLR4 gene fragment圖1 BSP擴增引物及TLR4基因片段中CpG位點

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism 8進行統計學處理，計量資料以表示，符合正態分布的數據組間比較采用t檢驗，相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝臟表面及切片觀察 肉眼觀察，正常組大鼠肝臟顏色偏深紅色，肝臟大小、形態如常，包膜光滑清晰，肝緣角較銳；實驗24 周末模型組大鼠肝臟顏色淡黃，肝臟偏大，形態飽滿，肝緣角變鈍，見圖2。顯微鏡下觀察HE染色的肝臟切片可發現，正常組肝細胞結構完整，呈放射狀排列。與正常組相比，模型組大鼠肝臟組織結構不明顯，肝細胞內出現大量脂滴，且肝臟內炎性細胞浸潤明顯，見圖3。

Fig.2 Pictures showing liver surface of normal group and model group圖2 正常組與模型組肝臟表面觀察

Fig.3 HE staining of normal group and model group(×100)圖3 正常組與模型組HE染色（×100）

2.2 2組大鼠肝臟指數及血液檢測指標 與正常組相比，模型組大鼠肝指數顯著升高，血清中ALT、AST、TC 及TG 水平均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 2 組大鼠肝臟中CD68 蛋白的表達 與正常組相比，模型組棕黃色區域顯著增加，肝臟中CD68 蛋白表達明顯升高，見圖4。

Tab.2 Blood test indicators of normal group and model group表2 正常組與模型組大鼠血液檢測指標 （n=10）

Tab.2 Blood test indicators of normal group and model group表2 正常組與模型組大鼠血液檢測指標 （n=10）

＊＊P＜0.01

Fig.4 Pictures showing expressions of CD68 protein in liver of normal group and model group(×200)圖4 正常組與模型組肝臟CD68蛋白的表達（×200）

2.4 2 組大鼠肝臟中TLR4 蛋白及其mRNA 表達水平比較 與正常組相比，模型組中TLR4蛋白含量及其mRNA 相對含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），見表3，圖5。

Tab.3 Comparison of expressions of relative content of TLR4 protein,TLR4 mRNA and TLR4 gene methylation rates in normal and model rats表3 正常組與模型組大鼠肝臟TLR4蛋白、mRNA表達及TLR4基因甲基化率比較 （n=10）

Tab.3 Comparison of expressions of relative content of TLR4 protein,TLR4 mRNA and TLR4 gene methylation rates in normal and model rats表3 正常組與模型組大鼠肝臟TLR4蛋白、mRNA表達及TLR4基因甲基化率比較 （n=10）

＊＊P＜0.01

組別正常組模型組t TLR4蛋白表達0.03±0.01 0.16±0.02 17.253＊＊TLR4 mRNA表達1.03±0.10 2.01±0.17 19.741＊＊TLR4基因甲基化率（%）82.76±4.61 55.28±6.08 12.311＊＊

Fig.5 Expressions of relative content of TLR4 protein in liver of normal group and model group圖5 正常組與模型組肝臟TLR4蛋白相對含量的表達

2.5 2 組大鼠TLR4 基因甲基化水平比較 BSP 檢測結果發現，與正常組相比，模型組大鼠4個甲基化位點中24、134、224及229號甲基化位點甲基化率下降，總甲基化率降低，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖6、7，表3。

Fig.6 Methylation rate of TLR4 gene of rat liver圖6 大鼠肝臟TLR4基因甲基化率

Fig.7 Methylation rates of 4 methylation sites in normal and model groups圖7 正常組與模型組4個甲基化位點的甲基化率

2.6 TLR4 基因與甲基化水平的相關性分析 通過對TLR4 mRNA 相對含量與甲基化程度的相關性分析顯示，TLR4的甲基化水平與其mRNA相對含量的表達呈負相關（P＜0.01），見圖8。

3 討論

Fig.8 Correlation analysis between TLR4 gene and methylation level圖8 TLR4基因與甲基化水平的相關性分析

NAFLD 的發病機制尚未明確，最經典的學說是Day 和James 提出的“二次打擊”學說［6］。初次打擊主要為IR、脂質代謝異常和肝細胞脂質堆積。第二次“打擊”主要包括反應性氧化代謝產物增多，導致脂質過氧化、線粒體功能障礙以及肝細胞發生氣球樣變和壞死性炎癥［7］。最新研究表明，“二次打擊”尚不足以描述NAFLD相關聯的多種致病途徑，而遺傳因素、脂質代謝紊亂、IR 及炎癥、氧化應激、肝細胞脂肪變性、內質網應激及腸道菌群失調等“多重平行打擊”可能是引起NAFLD 的重要原因，其中遺傳因素及炎癥的產生在NASH發病階段起到重要致病作用［8］。

NAFLD 的發生、發展受遺傳基因的調節。其中表觀遺傳學DNA甲基化的變化在NASH發病遺傳因素中發揮重要作用。營養過剩、運動量過少、壓力過大等不健康的生活方式皆可影響DNA 甲基化水平的變化。一項23 例單純性脂肪肝患者及22 例NASH 患者參加的研究表明，與單純性脂肪肝患者相比，NASH患者體內線粒體編碼的NADH脫氫酶6（NADH dehydrogenase 6，MT-ND6）基因甲基化水平顯著升高，且與NAFLD 的嚴重程度呈正相關，提示線粒體基因的DNA 甲基化水平在NAFLD 的發展和發病機制中起關鍵作用［9］。NAFLD患者肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor γ，PPARγ）的表觀遺傳修飾有助于IR 恢復，同時肝臟PPARγ 共激活因子1α 和線粒體轉錄因子A 的甲基化水平皆與空腹胰島素和IR 穩態模型評估相關［10］。雖然DNA 甲基化水平變化在NAFLD 線粒體功能障礙及胰島素抵抗等方面已被證實發揮了重要作用，但DNA 甲基化與TLR4 的相關研究在NASH 中還鮮見報道，故本研究從經典的炎癥相關蛋白TLR4 出發，探討NASH 中TLR4 的表達與其甲基化水平的相關性。

TLR4由許多免疫和非免疫細胞表達，與機體的損傷和感染信號的識別及轉導密切相關，在組織損傷、感染和炎癥中起到了“橋梁”作用。研究發現，在高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝小鼠中，富半胱氨酸 蛋 白61（cysteine-rich angiogenic inducer 61，CCN1）蛋白通過TLR4/MyD88/AP-1 信號通路升高明顯，進而導致炎癥的進展［11］。本課題組前期通過動物實驗研究發現，NASH 模型大鼠LPS、腫瘤壞死因子、TLR4、β 干擾素TIR 結構域銜接蛋白（TIR domain containing adaptor protein inducing interferonβ，TRIF）表達明顯升高，出現腸源性內毒素血癥，大量IR 的觸發因子LPS 促使TLR4 表達升高，進而使下游蛋白TRIF 表達升高，激活核內基因，產生大量炎性因子，表明LPS-TLR4-TRIF通路產生炎性因子貫穿于NASH 發病始終［12-13］。CD68 主要表達于單核-巨噬細胞的胞漿蛋白，是巨噬細胞可靠的標記物［14］。通過觀察各組大鼠切片中CD68的表達情況，可明顯觀察到巨噬細胞的變化，使得各組大鼠肝臟組織中TLR4蛋白的表達得到驗證。本實驗中，模型組CD68表達顯著高于正常組，表明模型組中巨噬細胞含量增加，與TLR4的表達相一致。

本實驗從表觀遺傳學角度探討TLR4 基因甲基化水平在NASH 大鼠模型中表達含量的變化，結果表明，在NASH 發生發展的過程中，TLR4 基因的高表達可能與其甲基化水平的降低有關。本研究有望為NASH的臨床研究提供新思路和新方向。