衢枳殼總黃酮提取工藝的優化及其抗氧化活性

劉小娟，方月娟，夏道宗，王思為

（1.衢州市婦幼保健院，浙江衢州 324000； 2.浙江中醫藥大學，浙江杭州 310053； 3.衢州市人民醫院，浙江衢州 324000）

常山胡柚是蕓香科柑橘屬植物柚與甜橙的雜交品種，主要產自浙江省衢州市常山縣，為我國特有品種［1］，其干燥未成熟果實于2016 年8 月以“衢枳殼”之名被納入2015 年版《浙江省中藥炮制規范》，可以作為中藥使用［2］，在2018 年3 月又被浙江省經濟和信息化委員會列入“新浙八味”中藥材培育品種名單［3］。衢枳殼性微寒，味苦、辛、酸，具有寬胸理氣、止咳化痰、清熱解毒、抗氧化等功效，其主要成分是黃酮類、揮發性成分［4-6］，但目前對其報道較少［7］。因此，本實驗采用正交試驗優化衢枳殼總黃酮提取工藝，并研究其抗氧化活性，以期為該藥材開發應用奠定基礎。

1 材料

1.1 試劑與藥物 衢枳殼購于衢州南孔中藥有限公司，經衢州市藥品食品檢驗研究院宋劍鋒主任中藥師鑒定為正品。DPPH、ABTS 自由基購于美國Sigma-Aldrich 公司；蘆丁（純度95%） 對照品購于上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸購于廣東光華化學廠有限公司。冰醋酸、無水乙醇購于國藥集團化學試劑有限公司；95%乙醇購于上海凌峰化學試劑有限公司；5% NaNO2、10% Al （NO）3、NaOH 等均為分析純。

1.2 儀器 FA2004 型電子天平、752 型紫外分光光度計（上海菁海儀器有限公司）；KQ-250DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mill-Q 型去離子水制備系統（美國Millipore 公司）。

2 方法與結果

2.1 總黃酮含有量測定 參考文獻［8］報道。精密稱取95% 蘆丁對照品15.0 mg，置于100 mL量瓶中，乙醇溶解定容至0.15 mg／mL，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 至另一量瓶中，30% 乙醇定容至5 mL，加入5% NaNO2溶液0.50 mL，振搖后靜置5 min，加入10%Al （NO3）3溶液0.30 mL，振搖后放置6 min，加入1.0 mol／mL NaOH 溶液2.0 mL，30%乙醇定容至10 mL，混合均勻，15 min 后在510 nm 波長處測定吸光度。以蘆丁含有量為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.000 8X-0.008 1（R2＝0.999 1），在0～600 μg／mL范圍內線性關系良好。

取衢枳殼適量，60 ℃下烘干后粉碎，過40 目篩，精密稱取10.00 g，加入一定體積分數乙醇混合均勻后在適當溫度下提取一段時間，靜置冷卻，濾過，置于50 mL 量瓶中，乙醇定容，得到供試品溶液，取1 mL，在510 nm 波長處測定吸光度，計算提取率，公式為提取率＝m1／M×100% （m1為總黃酮質量，M為藥材質量），其中m1＝供試液中總黃酮含有量×供試液體積×稀釋倍數。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數 取5 g 衢枳殼，固定料液比為1∶20，在80 ℃下加入60%、65%、70%、75%、80%乙醇提取2 h，結果見圖1。由此可知，乙醇體積分數在60%～75%范圍內時總黃酮提取率隨著其升高而增加，在75% 時最高，為5.68%，但進一步升高時提取率反而逐漸降低。因此，選擇70%、75%、80%進行試驗。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.2.2 提取時間 取5 g 衢枳殼，加入60%乙醇，固定料液比為1∶20，在80 ℃下提取1、1.5、2、2.5、3 h，結果見圖2。由此可知，提取1～2 h 時總黃酮提取率升高不明顯；2 h 后提取率升高程度較快，在2.5 h 時最高，為4.74%；進一步延長時提取率升高程度緩慢，甚至有下降趨勢，可能與溶劑對總黃酮的溶解達到飽和所致。因此，選擇2、2.5、3 h 進行試驗。

圖2 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 料液比 取5 g 衢枳殼，加入60% 乙醇，在80 ℃下按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30提取2 h，結果見圖3。由此可知，料液比在1∶10～1∶20 范圍內時總黃酮提取率升高程度緩慢；增加至1∶25 時提取率最高，為4.61%；大于1∶25 時提取率略有上升，但程度不明顯。因此，選擇1∶20、1∶25、1∶30 進行試驗。

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2.4 提取溫度 取5 g 衢枳殼，加入60%乙醇，固定料液比為1∶20，在60、65、70、75、80、85 ℃下提取2 h，結果見圖4。由此可知，初期隨著提取溫度增加，總黃酮提取率不斷升高，在75 ℃時最高；繼續增加時提取率不升反降，其原因可能是溫度過高導致總黃酮部分被破壞。因此，選擇70、75、80 ℃進行試驗。

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.3 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選擇乙醇體積分數（A）、提取時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D） 作為影響因素，總黃酮提取率（Y）作為評價指標［8］，采用L9（34） 正交表設計試驗。因素水平見表1，結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

由此可知，各因素影響程度依次為料液比（C） ＞提取溫度（D） ＞乙醇體積分數（A） ＞提取時間（B），因素C對總黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05），而其他3 種因素影響不顯著（P＞0.05）。結合表2 可知理論最佳組合為A3B1C3D3，但提取溫度對提取率無明顯影響，而且其過高會對總黃酮造成一定破壞，故選擇其為80 ℃ （D2）。最終確定，最優工藝為料液比1∶30，提取溫度80 ℃，乙醇體積分數80%，提取時間2 h，總黃酮提取率為6.2%。

表2 試驗設計與結果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.4 驗證試驗 稱取2 g 衢枳殼，按“2.3”項下優化工藝提取3 次，測得總黃酮提取率分別為6.19%、6.20%、6.23%，平均6.21%，與預測值6.2%接近，表明工藝穩定可靠，重復性好。

2.5 體外抗氧化活性研究

2.5.1 清除DPPH 自由基 參考文獻［9-11］報道，并略作調整。精密稱取DPPH 自由基20 mg，250 mL 無水乙醇定容至2×10-4mol／L。取不同質量濃度總黃酮溶液各2 mL，在同一具塞管中加入上述DPPH 溶液，振搖混勻，室溫避光條件下靜置30 min，以無水乙醇為對照，在517 nm 波長處測定其吸光度Aa；取上述DPPH 溶液與等體積（2 mL）無水乙醇的混合液，以及不同質量濃度總黃酮溶液與等體積（2 mL） 無水乙醇的混合液，在517 nm 波長處分別測定吸光度Ac、Ab，計算清除率，公式為清除率＝ ｛ ［1-（Aa-Ab）］／Ac｝ ×100%，并求得IC50，通過Graphpad Prism6 軟件進行處理，結果見圖5。由此可知，隨著總黃酮溶液質量濃度升高，其清除DPPH 自由基的能力逐漸增強，在5～1 000 μg／mL 范圍內的清除率由7.58%升至88.537%。

圖5 總黃酮對DPPH 自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of total flavonoids on DPPH free radical

2.5.2 清除ABTS 自由基 參考文獻［12］報道。將ABTS 自由基事先配成0.087 5 mmol／L 溶液，以0.4 mL 70%乙醇為對照品；取不同質量濃度總黃酮溶液0.4 mL，移入3.6 mL 上述溶液中，渦旋混合后置于避光處，10 min 后在734 nm 波長處測定吸光度A734，計算清除率，公式為清除率＝ （1-樣品管A734／對照管A734） ×100%，并求得IC50，通過Graphpad Prism6 軟件進行處理，結果見圖6。由此可知，總黃酮溶液質量濃度在5～1 000 μg／mL 范圍內時，對ABTS 自由基的清除率由6.236%升至99.054%，并且從250 μg／mL 開始與維生素C相當。

圖6 總黃酮對ABTS 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of total flavonoids on ABTS free radical

3 討論與結論

本實驗在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化衢枳殼總黃酮提取工藝，得到最佳參數為乙醇體積分數80%，料液比1∶30，提取時間2.0 h，提取溫度80 ℃，總黃酮提取率達6.21%，而且該方法簡便快速，無污染，可避免浸出更多無效成分，有利于進一步分離純化。優化后，衢枳殼總黃酮提取液對ABTS 自由基的清除能力與維生素C 相當，而對DPPH 自由基的清除率達88.537%，表明其體外抗氧化活性顯著，并呈量效依賴關系。

自從2015 年衢枳殼作為中藥被納入《浙江省中藥炮制規范》 以來，關于其有效成分及藥理作用的文獻有所增加［13-15］，但還是偏少，而相關研究可對該藥材種植、采栽、炮制方法的確定起到推動作用，促進浙江道地藥材資源的保護與開發，并能不斷鞏固和提高浙江中藥品牌的影響力。同時，該藥材的抗氧化活性能作為潛在抗氧劑應用于食品和藥品中，從而為其綜合利用奠定理論基礎。

今后，課題組將進一步研究衢枳殼總黃酮與抗氧化有關的藥理活性及其作用機制，如改善呼吸道炎癥反應、哮喘等，以期將其開發成安全性高、療效確切的相關藥物。