烏腺金絲桃-丹參藥對提取工藝的優(yōu)化

李永鑫，高彥宇，李文慧，沈芳玲，李 冀

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

烏腺金絲桃為藤黃科金絲桃屬植物，其味苦，性平，歸心經(jīng)，可用于治療心臟病［1-3］，而丹參為治療心血管疾病的常用中藥，前者功效清心瀉火除煩，后者功效活血涼血安神，兩藥配伍，對心火亢盛、瘀血阻滯者尤佳。本實驗在烏腺金絲桃-丹參藥對前期臨床及藥理實驗［4-7］的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并參考2015年版《中國藥典》［8］測定金絲桃苷、丹參酮ⅡA含有量，以期為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Nexera X2 LC30-A、Nexera X2 SIL-30AC、Nexera X2 SPD-M30A 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；AL204 電子分析天平（萬分之一）；SK5200HP 超聲波清洗器；Millipore 純水儀；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；HH-501 型恒溫水浴鍋；MIKRO 220R 超高速低溫離心機。

1.2 試劑與藥物 烏腺金絲桃由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院提供，丹參購自市場，均經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為正品。金絲桃苷對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-16102605，純度≥99%）；丹參酮ⅡA對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號6GYZ-4GE2，純度≥99%）。磷酸為優(yōu)級純，乙腈、甲醇為色譜純，均購自美國Sigma公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shim-pack XR-ODS Ⅱ色譜柱（2.0 mm×100 mm，2.2 μm）；流動相0.1% 磷酸（A） -乙腈 （B），梯度洗脫 （0～1 min，10%～15%B；1～6 min，15%～19%B；6～8 min，19%～25% B；8～18 min，25%～50% B；18～23 min，50%～65% B；23～25 min，65%～80% B；25～30 min，80%～100%B）；體積流量0.4 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm （丹參酮ⅡA）、360 nm（金絲桃苷）。色譜圖見圖1。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

2.2 對照品溶液制備 精密稱取金絲桃苷對照品1.2 mg、丹參酮ⅡA對照品6.0 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解后定容至刻度，各取5 mL 于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得（金絲桃苷、丹參酮ⅡA質(zhì)量濃度分別為24、120 μg／mL）。

2.3 供試品溶液制備 按1∶2 比例稱取烏腺金絲桃、丹參共30 g，回流提取后提取液定容至300 mL，取10 mL 上清液減壓濃縮至干，甲醇溶解，4 ℃、6 000 r／min 下離心10 min，濾液置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，0.22 μm 有機濾膜過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.2”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得金絲桃苷、丹參酮ⅡA方程分別為Y＝24 314X-1 191.1 （R2＝0.998 9）、Y＝61 911X＋39 305 （R2＝0.998 4），分別在2.4～21.6、12～108 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗 取“2.2”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定5 次，測得金絲桃苷、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為0.86%、1.25%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、3、6、9、12 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得金絲桃苷、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為1.82%、2.56%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批藥材5 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下各進樣5 μL 測定，測得金絲桃苷、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為1.77%、2.01%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取各成分含有量已知的供試品溶液3 組，每組平行2 份，按80%、100%、120%水平加入對照品，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，金絲桃苷、丹參酮ⅡA平均加樣回收率分別為98.55%、100.33%，RSD 分別為1.59%、2.01%。

2.5 單因素試驗 以乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)為影響因素，金絲桃苷、丹參酮ⅡA含有量為評價指標，權(quán)重系數(shù)分別設(shè)定為1、2，計算綜合評分（Y），公式為Y＝ （金絲桃苷含有量／最大值） ×100×1×1／3＋（丹參酮ⅡA含有量／最大值） ×100×2×1／3。

2.5.1 乙醇體積分數(shù) 按1∶2 比例稱取烏腺金絲桃、丹參共30 g，固定料液比1∶10，提取時間1 h，提取次數(shù)1 次，考察乙醇體積分數(shù)50%、60%、70%、80%、90%對綜合評分的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，80% 乙醇提取時綜合評分最高，故選擇70%、80%、90%作進一步研究。

2.5.2 料液比 按1∶2 比例稱取烏腺金絲桃、丹參共30 g，固定乙醇體積分數(shù)80%，提取時間1 h，提取次數(shù)1 次，考察料液比1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24 對綜合評分的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，料液比1∶12 提取時綜合評分最高，故選擇1∶8、1∶12、1∶16 作進一步研究。

2.5.3 提取時間 按1∶2 比例稱取烏腺金絲桃、丹參共30 g，固定乙醇體積分數(shù)80%，料液比1∶12，提取次數(shù)1 次，考察提取時間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 對綜合評分的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，提取2 h 時綜合評分最高，故選擇1.5、2.0、2.5 h 作進一步研究。

2.5.4 提取次數(shù) 按1∶2 比例稱取烏腺金絲桃、丹參共30 g，固定乙醇體積分數(shù)80%，料液比1∶12，提取時間2 h，考察提取次數(shù)1、2、3 次對綜合評分的影響，結(jié)果見圖2。由此可知，隨著提取次數(shù)增加綜合評分升高，但提取2 次或3 次無明顯差異，考慮到工業(yè)生產(chǎn)實際情況，故選擇2 次。

圖2 各因素對綜合評分的影響Fig.2 Effects of various factors on comprehensive score

2.6 Box-Behnken 響應(yīng)面法 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C） 作為影響因素，金絲桃苷、丹參酮ⅡA含有量作為評價指標，按“2.5”項下方法計算綜合評分（Y）。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

通過Design-Expert 8.0.6 軟件進行擬合，得方程為Y＝91.88 ＋1.19A＋7.71B-1.06C＋0.72AB＋1.73AC-2.05BC-5.46A2-9.26B2-1.60C2（R2＝0.920 1），方差分析見表3。由此可知，因素B、A2、B2有顯著影響（P＜0.05）；模型P＜0.05，失擬項P＞0.05，表明方程擬合度較高，預(yù)測性較好。響應(yīng)面分析見圖3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.3 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖3 各因素響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots for various factors

2.7 驗證試驗 通過Design Expert 8.0.軟件，得到最優(yōu)工藝為加入13.87 倍量80.52% 乙醇提取1.74 h，根據(jù)實際生產(chǎn)，將其修正為加入14 倍量80%乙醇提取1.75 h，綜合評分94.09。按1∶2 比例稱取烏腺金絲桃、丹參共30 g，在上述優(yōu)化工藝下進行3 批驗證試驗，測得綜合評分平均值為93.22，與預(yù)測值94.09 接近，表明工藝穩(wěn)定合理。

3 討論

金絲桃苷為烏腺金絲桃主要黃酮類成分［9］，具有抗心肌脂質(zhì)過氧化的作用［10-11］；丹參主要脂溶性成分為丹參酮，其中丹參酮ⅡA含有量最高，具有保護心肌、擴張冠脈、抑制血管平滑肌細胞增殖、抗動脈粥樣硬化等活性［12-14］。課題組前期研究表明，烏腺金絲桃-丹參藥對活性部位可抗心肌缺血再灌注損傷，兩者最佳配伍比例為1∶2［15］。本實驗參考2015 年版《中國藥典》，選擇金絲桃苷、丹參酮ⅡA作為評價指標對該藥對提取工藝進行優(yōu)化。

由于投料量過小不利于工藝考察，故本實驗將藥材制成粗粉提取，可減少質(zhì)地不均造成的影響。考慮到金絲桃苷、丹參酮ⅡA紫外最大吸收波長不同，本實驗采用全波長掃描；流動相考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.1% 磷酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸分離效果最好。

本實驗先通過單因素試驗篩選響應(yīng)面范圍，并參考藥對配伍比例及指標成分含有量設(shè)置評分權(quán)重，再通過Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化烏腺金絲桃-丹參藥對提取工藝。結(jié)果表明，上述方法可用于該藥對脂溶性成分的提取，能為其后續(xù)質(zhì)量標準及藥理活性的研究提供依據(jù)。