HPLC 法同時測定保兒寧顆粒中10 種成分

劉加元，張建超

（1.湖北省第三人民醫院藥學部，湖北武漢 430033； 2.湖北中醫藥大學藥學院，湖北武漢 430065）

保兒寧顆粒是由炙黃芪、防風、茯苓、炒白術、蘆根、雞內金、炒山藥7 味藥材加工而成的兒科用中成藥，具有益氣固表、健中醒脾之功效，用于脾肺氣虛所致的神倦納呆、面黃肌瘦、煩燥不寧、表虛自汗、易感風邪等病癥的治療［1］。研究表明，它能顯著延長小鼠缺氧情況下的存活時間，增加小鼠體體質量和食欲［2］；對小兒反復呼吸道感染療效顯著［3］，可增加呼吸道免疫功能［4］，對哮喘合并反復呼吸道感染引起免疫功能紊亂的療效明顯［5］，有效改善變應性鼻炎合并哮喘患兒免疫功能，減少呼吸道感染發生，減輕變應性鼻炎和哮喘的臨床癥狀［6］；聯合布地奈德、孟魯司特時，治療小兒變應性鼻炎臨床效果理想［7-12］，而聯合利巴韋林、阿昔洛韋時，能明顯提高反復呼吸道感染患兒身體抵抗力［13］。

保兒寧顆粒收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》 （中藥成方制劑第十五冊）［1］，但未對方中成分進行定量分析，前期文獻也僅涉及其所含的黃芪甲苷、升麻素苷［14-15］。中藥及其復方制劑成分復雜，單一成分難以全面評價其質量，多組分質量控制模式已逐漸應用于相關檢測中。本實驗采用HPLC 法對保兒寧顆粒中毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的含有量同時進行測定，以期為該制劑多指標成分控制和質量標準完善提供參考依據。

1 材料

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB135-S 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（批號111920-201606，純度97.6%）、升麻素苷（批號111522-201712，純度96.2%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號111523-201811，純度97.4%） 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；亥茅酚苷（批號15012605，純度96.9%）、去氫茯苓酸（批號14032101，純度 99.4%）、茯苓酸 （批號15030404，純度98.6%） 對照品均購于成都普瑞法科技開發有限公司；芒柄花苷（批號17081841，純度98.2%）、芒柄花素（批號16122221，純度99.0%）、升麻素（批號18042043，純度99.8%）、去氫土莫酸（批號17091513，純度98.2%） 對照品均購于上海同田生物技術股份有限公司；缺炙黃芪、缺防風、缺茯苓、缺炒白術、缺蘆根、缺雞內金、缺炒山藥陰性樣品均購于武漢市神草中藥飲片有限責任公司，經湖北中醫藥大學張建超副教授鑒定為正品，按相關質量標準檢驗均符合規定。保兒寧顆粒（每袋裝10 g，批號20180709、20181002、20190304） 購于貴州百靈企業集團正鑫藥業有限公司。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Extend XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相［乙腈-甲醇（9∶1）］（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～13.0 min，35.0% A；13.0～34.0 min，35.0%～44.0%A；34.0～55.0 min，44.0%～70.0%A；55.0～69.0 min，70.0%～92.0% A；69.0～75.0 min，92.0%～35.0% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm （0～55.0 min，毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷）［16-18］、210 nm （55.0～75.0 min，去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸）［19-20］；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇溶解稀釋成分別含毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸1.116、0.784、1.468、3.592、1.024、1.956、0.832、0.356、0.264、0.428 mg／mL的貯備液，各精密量取2.5 mL，置于同一100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（各成分含有量分別為27.9、19.6、36.7、89.8、25.6、48.9、20.8、8.9、6.6、10.7 μg／mL）。

2.3 供試品溶液 取顆粒適量，研細，取粉末約2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質量，超聲 （200 W、40 kHz）提取30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液 按處方比例及工藝，分別制備缺炙黃芪、缺防風、缺茯苓的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 系統適應性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分色譜峰基線平穩，峰形對稱，分離度均大于1.5，理論塔板數按各成分計均低于4 000，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.2 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6 個25 mL 量瓶中，甲醇依次稀釋成20 倍質量濃度差的溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度試驗 取“2.2”項對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為 0.63%、1.11%、0.76%、0.59%、1.02%、1.17%、0.80%、1.25%、1.39%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 取同一批顆粒適量，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸含有量RSD 分別為1.02%、1.66%、1.24%、0.97%、1.57%、0.43%、1.39%、1.78%、0.86%、1.70%，表明該方法重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、12、18 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積RSD 分別為0.59%、1.08%、0.72%、0.61%、0.99%、1.23%、0.85%、1.19%、1.44%、1.10%，表明溶液在18 h 內穩定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 取同一批各成分含有量已知的顆粒適量，研細，取9 份，每3 份為1 組，每份約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，按照2015 年版《中國藥典》 四部要求，將高、中、低質量濃度對照品溶液加入量與供試品溶液中待測成分含有量的比例分別控制在1.5∶1、1∶1、0.5∶1，精密加入對照品溶液（含毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 0.338 mg／mL、芒柄花苷0.218 mg／mL、芒柄花素0.473 mg／mL、升麻素苷1.123 mg／mL、升麻素0.327 mg／mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷 0.639 mg／mL、亥茅酚苷0.287 mg／mL、去氫土莫酸0.119 mg／mL、去氫茯苓酸0.082 mg／mL、茯苓酸0.159 mg／mL） 0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸平均加樣回收率分別為98.41%、97.65%、99.08%、100.01%、98.10%、99.94%、98.29%、97.34%、96.91%、97.93%，RSD 分別為1.21%、1.53%、0.93%、0.77%、1.39%、0.66%、1.65%、1.41%、0.96%、1.14%。

2.6 樣品含有量測定 取3 批顆粒，研細，取約2.0 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 指標成分選擇 保兒寧顆粒中黃芪補脾益肺，固表止汗，而白術健脾扶正，補中焦而滋氣血之源，合為君藥；山藥健脾補肺，益腎填精，而茯苓滲濕健脾，寧心安神，可增芪術之效，合為臣藥；防風祛風邪，而蘆根防久補生熱，合為佐藥；雞內金和胃健脾，為使藥，諸藥合用，共奏益氣固表、健中醒脾之功效。參考中藥質量標志物以君藥為主，臣、佐、使藥兼顧的確定原則［21-24］，本實驗選擇方中炙黃芪所含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素，茯苓所含去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸，防風所含升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷作為指標成分，可實現保兒寧顆粒中多成分的質量控制。

3.2 供試品溶液制備方法選擇 本實驗首先考察了提取溶劑（50%甲醇［17］、甲醇［16，18-20，25］、50%乙醇、乙醇），發現以甲醇為提取溶劑時各成分綜合提取率最佳，再考察了提取方式（超聲［16，19-20，25］、加熱回流［17-18］）、提取時間 （15 min、30 min、45 min）對各成分綜合提取效果的影響。最終，確定甲醇超聲提取30 min 作為供試品溶液制備方法。

3.3 流動相選擇 本實驗首先采用不同比例甲醇-水、乙腈-水梯度洗脫，發現無法兼顧各成分的分離度、峰形、出峰時間。參考文獻［25］，以乙腈-甲醇（9∶1） 與水為流動相進行梯度洗脫，發現上述情況有了明顯改善，但色譜圖基線仍存在漂移現象，并且檢測時間長，芒柄花苷、去氫茯苓酸存在拖尾，故又在水相中加入適量酸（0.1%甲酸［16］、0.1%磷酸［19-20］、0.1% 冰醋酸），同時對流動相比例不斷調整。最終，確定乙腈-甲醇 （9∶1） 與0.1%甲酸作為流動相，按“2.1”項下比例進行梯度洗脫。

4 結論

本實驗首次建立HPLC 法同時測定保兒寧顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷、去氫土莫酸、去氫茯苓酸、茯苓酸的含有量，發現該方法簡便可靠，檢測時間短，可為該制劑質量控制和綜合評價提供依據。