HPLC 法同時測定藤黃健骨膠囊中9 種成分

陳海燕，劉華東*，李 冰，韋素華

（1.廣西衛生職業技術學院，廣西南寧 530023； 2.廣西明合藥業有限責任公司，廣西南寧 530020）

藤黃健骨膠囊現收錄于《國家食品藥品監督管理總局藥品標準》 （YBZ06272008），由熟地黃、雞血藤、淫羊藿、鹿銜草、肉蓯蓉、炒萊菔子、燙骨碎補7 味藥材加工而成，具有補腎、活血、止痛的功效，臨床上主要用于肥大性脊椎炎、頸椎病、跟骨刺、增生性關節炎、大骨節病等病癥的治療［1］，對腎虛血瘀型骨質疏松癥［2］、腰椎間盤突出癥［3］、腰椎骨折合并嚴重骨質疏松癥［4］、椎動脈型頸椎病［5］、原發性骨質疏松癥［6］、骨性關節炎［7］、早期四肢骨折［8］、腰肌勞損［9］等疾病的臨床療效顯著。但目前該制劑現行質量標準和文獻［10-11］僅對方中臣藥淫羊藿所含淫羊藿苷進行定量分析，尚無多組分含有量測定的報道。因此，本實驗采用HPLC 法同時測定藤黃健骨膠囊中君藥熟地黃活性成分梓醇、地黃苷D、益母草苷，臣藥淫羊藿活性成分淫羊藿苷、寶藿苷I，佐藥雞血藤活性成分兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素的含有量，建立該制劑多指標成分的質量控制模式，以期為全面評價其質量提供數據支持。

1 材料

Dionex UltiMate3000 型高效液相色譜儀 （美國Thermo Fisher 公司）；BS110S 型電子分析天平（德國Sartorious 公司）；KQ-300DE 型數控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。兒茶素（批號110877-201604，純度99.2%）、表兒茶素（批號110878-201703，純度99.7%）、淫羊藿苷（批號110737-201516，純度94.2%）、寶藿苷I（批號111852-201603，純度99.9%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；地黃苷D （批號14061708，純度98.8%） 對照品購自成都普瑞法科技開發有限公司；梓醇（批號17071021，純度98.6%）、益母草苷（批號18052422，純度94.6%）、甘草素（批號18111522，純度99.4%）、美迪紫檀素（批號18040322，純度100.0%） 對照品均購自上海同田生物技術股份有限公司。熟地黃、雞血藤、淫羊藿、鹿銜草、肉蓯蓉、炒萊菔子、燙骨碎補均購自廣西岑溪市安陽堂藥業有限公司，經廣西衛生職業技術學院陳海燕講師鑒定為正品，按2015 年版《中國藥典》 一部各藥材質量標準檢驗均符合相關規定。藤黃健骨膠囊 （每粒裝0.25 g，批號181104、190105、190406） 購于甘肅省西峰制藥有限責任公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Shim-pack GIST C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～10.0 min，5.0%A；10.0～25.0 min，5.0%～10.0% A；25.0～47.0 min，10.0% →39.0% A；47.0～63.0 min，39.0%～45.0%A；63.0～70.0 min，45.0%～5.0%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；0～25.0 min在210 nm 波長處檢測梓醇、地黃苷D、益母草苷［12-13］，25.0～47.0 min 在280 nm 波長處檢測兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素［14-15］，47.0～70.0 min 在270 nm 波長處檢測淫羊藿苷、寶藿苷I［1，10-11，16-17］；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷和寶藿苷I 對照品適量，甲醇制成質量濃度分別為2.178、0.982、1.354、0.918、1.212、0.108、0.136、3.012、1.988 mg／mL 的貯備液，各精密量取2.5 mL，置于50 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（含梓醇108.9 μg／mL、地黃苷D 49.1 μg／mL、益母草苷67.7 μg／mL、兒茶素45.9 μg／mL、表兒茶素60.6 μg／mL、甘草素5.4 μg／mL、美迪紫檀素6.8 μg／mL、淫羊藿苷150.6 μg／mL、寶藿苷I 99.4 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊20 粒，傾出內容物，研細混勻后精密稱取2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質量，超聲（300 W、40 kHz） 提取30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按膠囊處方比例和生產工藝，分別制備缺熟地黃、缺雞血藤、缺淫羊藿的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，色譜圖基線平穩，各成分與其他雜質峰均能達到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數按各成分計均不低于3 500，陰性無干擾。

2.4 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6 個20 mL 量瓶中，甲醇制成6 個質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.5 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 峰面積RSD 分別為 0.77%、0.95%、0.78%、0.81%、0.99%、1.12%、1.06%、0.51%、0.64%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批膠囊，按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 峰面積RSD 分別為1.02%、1.35%、1.20%、1.47%、1.19%、0.85%、1.79%、0.97%、1.06%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 按“2.2.2”項下方法制備1份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 峰面積RSD 分別為0.79%、0.96%、0.75%、0.86%、1.03%、1.11%、1.07%、0.53%、0.67%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 含有量已知 （1.478、0.656、0.894、0.536、0.722、0.058、0.072、2.124、1.198 mg／mL） 的膠囊內容物9 份，每份1.0 g，置于具塞錐形瓶中，按照2015 年版《中國藥典》 規定加入對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL 各3 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 平均加樣回收率分別為99.71%、98.91%、99.26%、97.94%、98.32%、96.97%、96.95%、100.01%、98.96%，RSD 分別為 0.83%、0.96%、1.09%、1.45%、1.32%、0.99%、1.17%、0.76%、1.25%。

2.9 樣品含有量測定 取3 批膠囊，按“2.2.2”項下方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表2。

表2 各成分含有量測定結果（mg／粒， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／capsule， n＝3）

3 討論

3.1 指標成分篩選 藤黃健骨膠囊中熟地黃補血滋陰，益精填髓，為君藥，梓醇、益母草苷、地黃苷D 等環烯醚萜苷類為其主要活性成分；淫羊藿補腎陽，強筋骨，祛風濕，為臣藥，淫羊藿苷、寶藿苷I 等黃酮類為其主要活性成分；雞血藤活血補血，舒筋活絡，為佐藥，兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素等黃酮類為其主要活性成分。根據中藥質量標志物確認原則，本實驗選擇梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 作為指標成分。

3.2 供試品溶液制備方法篩選 本實驗首先考察不同提取溶劑（甲醇［10，13，16］、50%甲醇［12］、乙醇、50%乙醇［1，11，15，17］） 對藤黃健骨膠囊中9 種成分綜合提取率的影響，發現甲醇提取時最高，色譜圖中雜質峰數量少。再考察不同提取方式（超聲提取法［1，10-14］、回流提取法［15］、索氏提取法），發現各成分綜合提取率差異不大，考慮到制備便捷性和結果準確性，采用超聲提取。最后考察不同提取時間（30、60、90 min）。最終確定，供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。

3.3 流動相篩選 本實驗考察乙腈-水［1，10-12，16-17］、乙腈-0.2%磷酸［13-14］、乙腈-0.1%甲酸［15］流動相體系，發現以乙腈-0.2%磷酸洗脫時色譜峰分離度較好，基線平穩，故選擇其作為流動相。進一步對流動相比例進行優化，最終確定為“2.1”項下梯度洗脫程序。

4 結論

本實驗首次采用HPLC 法同時測定藤黃健骨膠囊中梓醇、地黃苷D、益母草苷、兒茶素、表兒茶素、甘草素、美迪紫檀素、淫羊藿苷、寶藿苷I 的含有量，再按照2015 年版《中國藥典》 四部藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行驗證。結果發現，該方法操作便捷，結果準確，重復性好，可用于該制劑的質量控制。