竹節參總皂苷調節大鼠海馬區自噬減輕腦缺血再灌注損傷

黃亞光，歐炳金，馮家騰，楊 彤，馮知濤，梅志剛

（三峽大學醫學院，國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室，湖北宜昌 443002）

腦卒中是嚴重危害人類健康的神經性疾病，最新的研究顯示，全球25 歲以上人群的發生風險為25%，而在我國最高，達39%［1］。缺血性腦卒中作為腦卒中最主要的類型，占60%～80%［2］，并且其發生風險約是出血性腦卒中風險的2 倍［1］。目前，其有效的治療手段是溶栓，但血液再次灌注很可能給受損組織帶來更嚴重的損傷，即腦缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CIR） 損傷。研究證實，CIR 損傷與炎癥、氧化應激、自噬、凋亡、鈣超載等有關［3-5］，其中自噬的作用日益成為研究熱點［6-7］，有望成為缺血性腦卒中治療的新策略。竹節參是五加科人參屬植物竹節參的干燥根莖，具有抗炎、改善學習記憶、抗腫瘤等功效［8-9］，總皂苷（tRPJSs） 是其有效活性成分，主要包括竹節人參皂苷Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，人參皂苷Re、Rgl、Rg2，三七皂苷R1、R2［9］，可以通過抑制細胞凋亡［10］、降低誘導型一氧化氮合酶活性［11］、抗氧化［12］、抑制興奮性氨基酸［13］等作用來減輕CIR 損傷，然而它是否能調控自噬尚不清楚。因此，本研究建立大鼠局灶性CIR 損傷模型，探討竹節參總皂苷對自噬的調節，從而揭示該成分防治缺血性腦卒中的潛在機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級健康雄性成年SD 大鼠40 只，體質量220～250 g，購自三峽大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK （鄂） 2011-0012。

1.2 藥物 竹節參購自湖北恩施椿木營竹節參種植基地，經三峽大學醫學院何毓敏博士鑒定為五加科植物竹節參Panax japonicusC.A.Mey 的干燥根莖。取藥材粗粉，加入60%乙醇回流提取3 次，合并濾液后濃縮干燥，得到總提物粉末。使用前，用生理鹽水將其稀釋至所需濃度。

1.3 試劑 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）試劑 （批號T8877-5G） 購自美國Sigma 公司；HRP 標記的山羊抗兔、β-actin 抗體購自武漢塞維爾生物有限公司；微管相關蛋白1 輕鏈3B（LC3B） 兔多抗（批號18725-1-AP）、p62 兔多抗（批號18420-1-AP） 購自武漢三鷹生物技術有限公司；水合氯醛（批號20150629） 購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 儀器 TS-1 水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；LD25-2 型低速離心機（北京京立離心機有限公司）；H-7500 透射電子顯微鏡（日本日立公司）；DYY-7C 電泳儀及DYCZ-40 電轉儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 分組及給藥 40 只大鼠隨機分為假手術組、模型組、竹節參總皂苷低劑量組（50 mg／kg）、竹節參總皂苷高劑量組（100 mg／kg），每組各10 只。適應性喂養3 d 后，竹節參總皂苷組大鼠按50、100 mg／kg 的劑量灌胃給藥，每天1 次，共7 d，末次給藥為術前30 min；假手術組、模型組大鼠灌胃給予生理鹽水（5 mL／kg），灌胃時間與竹節參總皂苷組相同。

2.2 局灶性CIR 損傷模型的建立 參照Longa等［14］的方法構建大鼠右側大腦中動脈阻斷缺血（MCAO） 模型。大鼠末次給藥30 min 后，10%水合氯醛（3.5 mL／kg） 腹腔注射麻醉，仰臥固定，剃去頸部毛發，酒精消毒，沿頸正中線切口，依次暴露右側頸總、頸外及頸內動脈。結扎頸總動脈近心端和頸外動脈，于頸總動脈分叉下方約5 mm處剪一 “V”型切口，將線栓 （長4 cm，直徑0.25 mm） 從開口處插入，置于頸內動脈17～18 mm，到有輕微阻力感為止，結扎頸內和頸總動脈遠心端以固定線栓，逐層縫合皮膚。大鼠缺血1.5 h 后，撥出線栓再灌注24 h。假手術組大鼠麻醉后，僅暴露頸內外動脈分支，不閉塞大腦中動脈，其他操作相同。術中、術后室溫嚴格控制在24～25 ℃，大鼠體溫維持在36.5～37.5 ℃。

2.3 神經功能評分 再灌注24 h 后，評估各組大鼠神經功能損傷，參照Longa 等［14］報道的方法進行神經功能評分：0 分，神經功能無障礙；1 分，提尾時向對側前肢屈曲；2 分，不能直行，大鼠向左側旋轉；3 分，行走困難，行走時向對側傾倒；4 分，嚴重意識障礙，無自發活動或意識不清。神經功能評分在0～3 分的大鼠表明造模成功，納入實驗，評分為4 分的剔除。

2.4 TTC 染色計算腦梗死體積 神經功能評分后，每組隨機選取3 只大鼠，麻醉后斷頭取腦，去嗅球、小腦和低位腦干，-20 ℃冷凍20 min 后沿冠狀面切成厚度基本相同的5 片，置于2% TTC 染色液中，37 ℃避光孵育30 min，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，取出切片拍照。采用Image J 圖像分析軟件測量大鼠腦梗死體積。腦梗死范圍百分比＝ ［5 片大腦總梗死區體積（白色區域） ／5 片大腦總體積（整個大腦體積）］×100%。

2.5 透射電鏡檢測自噬小體 再灌注24 h 后，每組隨機選取3 只大鼠，麻醉后生理鹽水灌注至肝臟及四肢發白，后繼續灌注4%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定至肝臟及四肢變硬，冰上斷頭取腦，分離腦組織，于缺血側海馬靠近CA1 區取一體積約1 mm3的腦組織塊，置于2.5% 戊二醛溶液固定24 h。PBS 漂洗3 次，1%鋨酸溶液4 ℃固定1 h，然后梯度乙醇溶液脫水，丙酮置換、浸透，環氧樹脂包埋。-80 ℃下聚合24 h 后，將組織塊制成60～70 nm厚的超薄切片，3%檸檬酸鉛-醋酸雙氧鈾雙染色，透射電子顯微鏡觀察海馬組織細胞中自噬小體的形成情況。

2.6 Western blot 檢測LC3、p62 蛋白表達 再灌注24 h 后，各組隨機選取3 只大鼠，麻醉后迅速斷頭取腦，稱取約0.3 g 海馬組織制備蛋白樣本，BCA 法檢測各樣本蛋白濃度。取30 μg 樣本上樣，以12%分離膠電泳分離，蛋白轉移至PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗LC3 B （1∶1 000）、p62 （1∶2 000） 后4 ℃搖床孵育過夜。TBST 洗膜3 次 （10 min／次），將PVDF 膜封入HRP 標記的二抗（山羊抗兔） 稀釋液（1∶2 000）中，室溫搖床孵育1 h，TBST 洗膜3 次 （每次10 min）。按照A 液、B 液1∶1 的比例配置ECL顯影液，將PVDF 膜充分浸入顯影液后放入凝膠成像儀器內顯影，實驗重復3 次。以β-actin 作為內參，Image J 軟件進行灰度值分析。

2.7 統計學分析 采用SPSS 19.0 軟件處理，數據以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVE），兩兩比較采用LSD 法（方差齊性時） 或Dunnett’s T3 法（方差不齊時）。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 竹節參總皂苷對神經功能損傷的影響 模型組大鼠表現出嚴重的神經功能損傷情況，與假手術組大鼠相比其神經功能評分升高（P＜0.01）；與模型組相比，竹節參總皂苷組大鼠神經功能評分均降低（P＜0.01）。見表1。

表1 竹節參總皂苷對大鼠神經功能損傷的影響（，n＝10）Tab.1 Effects of tRPJSs on neurological deficit of rats（，n＝10）

表1 竹節參總皂苷對大鼠神經功能損傷的影響（，n＝10）Tab.1 Effects of tRPJSs on neurological deficit of rats（，n＝10）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 竹節參總皂苷對腦梗死的影響 白色部分表示腦梗死區域，紅色部分表示非梗死區域。與假手術組相比，模型組大鼠腦梗死增加（P＜0.01）；與模型組相比，竹節參總皂苷組大鼠腦梗死均減小（P＜0.01），高劑量組更明顯。見圖1、表2。

圖1 竹節參總皂苷對大鼠腦梗死的影響Fig.1 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats

表2 竹節參總皂苷對大鼠腦梗死的影響（， n＝3）Tab.2 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats （，n＝3）

表2 竹節參總皂苷對大鼠腦梗死的影響（， n＝3）Tab.2 Effects of tRPJSs on cerebral infarct of rats （，n＝3）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.3 竹節參總皂苷對缺血側海馬CA1 區神經元細胞形態及自噬小體形成的影響 假手術組大鼠海馬神經元可見結構完整的細胞核、線粒體、溶酶體和內質網，而模型組大鼠神經元細胞器損傷，線粒體腫脹變形，部分線粒體內峭溶解消失，透明成空泡，可見包含內融物的自噬體及自噬溶酶體結構。竹節參總皂苷組與模型組相比，可見神經細胞核膜超微結構較完整、清晰，周圍可見內含胞漿成分的自噬體，也可見到少量單層膜，胞漿成分已降解的自噬溶酶體，且竹節參總皂苷高劑量組細胞損傷程度低于低劑量組。見圖2。

圖2 竹節參總皂苷對大鼠缺血側海馬CA1 區自噬小體形成的影響（×5 000）Fig.2 Effects of tRPJSs on neuronal cell morphology and the formation of autophagosomes in CA1 area of ischemic hippocampus of rats （×5 000）

3.4 竹節參總皂苷對大鼠缺血側海馬中LC3、p62蛋白表達的影響 與假手術組相比，模型組LC3-Ⅱ表達升高，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值增加，p62 表達降低（P＜0.01）；與模型組相比，竹節參總皂苷組LC3-Ⅱ表達均下調，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值降低，p62表達上調（P＜0.01）。見圖3、表3。

圖3 竹節參總皂苷對大鼠缺血側海馬中LC3 和p62 蛋白表達的影響Fig.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats

表3 竹節參總皂苷對大鼠缺血側海馬中LC3 和p62 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats （， n＝3）

表3 竹節參總皂苷對大鼠缺血側海馬中LC3 和p62 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.3 Effects of tRPJSs on the protein expressions of LC3 and p62 in ischemic hippocampus of rats （， n＝3）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

4 討論

缺血性腦卒中是由于腦缺血或血管堵塞造成大腦血流供應不足，引起腦組織損傷的一種疾病。目前，r-tPA 溶栓治療是美國FDA 唯一批準的療法，然而溶栓再灌注可能會進一步引起或加重一系列病理改變［15-16］，誘發CIR 損傷的發生，繼而導致不可逆的神經損傷。因此，如何有效的防治再灌注損傷的發生至關重要。

竹節參是湖北省特色藥用植物，其主要活性成分是竹節參總皂苷。研究顯示，竹節參總皂苷能通過抑制一氧化氮合酶和誘導型一氧化氮合酶的過度表達改善局灶性CIR 大鼠的腦損傷［11］。另有研究也發現，50、100 mg／kg 竹節參總皂苷能顯著提高CIR 大鼠腦組織的超氧化物歧化酶活力，降低乳酸脫氫酶活性和丙二醛含有量，抑制腦組織水腫［12］，提示竹節參總皂苷可能通過抗氧化應激和改善毛細血管通透性減輕CIR 損傷。新近的研究發現，竹節參的藥理作用可能與其對自噬的調控有關，鄧麗麗等［17］通過在SH-SY5Y 細胞中預孵育竹節參總皂苷發現，竹節參總皂苷能顯著逆轉H2O2處理導致的LC3-Ⅱ和Beclin1 蛋白的下調，推測竹節參總皂苷可能通過誘導自噬，減輕細胞氧化損傷，從而提高細胞的抗氧化能力。Wang 等［18］的研究發現，竹節參總皂苷能通過AMPK／mTOR／Ulk1 通路激活自噬，從而減輕異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化。然而，竹節參總皂苷對CIR 損傷的保護作用是否通過調控自噬尚未有報道。

基于上述理論，本研究試圖探討竹節參總皂苷預處理對CIR 損傷的保護作用，并驗證竹節參總皂苷通過調控自噬發揮作用。通過提前7 d 預給藥處理，MCAO 模型缺血1.5 h 再灌注24 h 后檢測相應的指標。結果顯示，與模型組相比，竹節參總皂苷預處理能夠顯著改善CIR 24 h 后大鼠的神經功能缺損，減輕腦梗死，改善神經元細胞結構，提示竹節參總皂苷預處理能夠發揮神經保護作用。

自噬體被認為是目前檢測自噬的金標準，能夠直觀的顯示組織細胞內自噬的情況。自噬體是自噬過程中形成的一種包裹有受損細胞器或蛋白質的囊泡，具有雙層膜結構，與溶酶體融合后變成單層膜結構［19］。LC3 是自噬過程中最重要的分子，以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式存在，主要參與自噬體的形成［20］。自噬底物蛋白p62 通過在C 端與泛素化蛋白結合以及N 端與LC3-Ⅱ結合參與自噬的降解［21］，同時檢測LC3 和p62 可以反應自噬的完整性。本研究中透射電鏡結果顯示，竹節參總皂苷預處理可以顯著改善大鼠缺血側海馬神經細胞損傷，減少自噬體的形成；Western blot 結果顯示，竹節參總皂苷預處理能顯著降低LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值，上調p62 蛋白表達，推測竹節參總皂苷預處理發揮神經保護作用可能是通過抑制大鼠CIR 24 h 后自噬的過度產生而實現的。

綜上所述，竹節參總皂苷預處理可能通過抑制大鼠CIR 24 h 后海馬區的過度自噬，而發揮對CIR損傷的保護作用。然而竹節參總皂苷調控自噬的具體作用機制尚需進一步探索，明確其在CIR 損傷中的具體作用機制。