紅花黃色素對糖尿病大鼠神經傳導速度的影響

何萬輝 簡小兵王文英趙志祥李慧枝*

（1.廣州中醫藥大學，廣東廣州 510504； 2.廣州醫科大學附屬中醫醫院，廣東廣州 510130）

糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN） 是糖尿病最常見的慢性并發癥之一，可導致糖尿病患者足部痛覺、溫度覺異常或缺失，因而成為患者發生足部潰瘍的最常見的危險因素［1］。氧化應激 （Oxidative stress，OS） 是糖尿病各并發癥發生的共同病理生理機制，在包括DPN 在內的多種糖尿病并發癥的發病過程中起重要作用［2］。神經生長因子（Nerve Growth Factor，NGF） 是神經營養因子家族成員之一，也是最早被發現、具有抗細胞凋亡、促進神經生長和分化等多重生物學功能的神經細胞生長調節因子［3-6］，其水平下降與DPN 發生、發展存在密切關系［7-8］。

既往研究發現注射用紅花黃色素能改善DPN 患者臨床癥狀［9-10］。但注射用紅花黃色素對DPN 的具體作用機制未明，本研究根據糖尿病大鼠坐骨神經傳導速度和NGF 水平探討注射用紅花黃色素對DPN 的防治作用及其機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體質量180～220 g，購自中山大學實驗動物中心東校園，實驗動物生產許可證號SCXK（粵） 2016-0029，使用許可證號SYXK（粵） 2016-0112。

1.2 試劑與藥物 注射用紅花黃色素（浙江永寧藥業股份有限公司，國藥準字Z20050146，批號1905213）；甲鈷胺注射液 ［衛材 （中國） 藥業有限公司，國藥準字J20070063，批號101271］。鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司，批號050401）；SOD ELISA 試劑盒（美國Biovision 公司，批號E4584-100）；MDA ELISA 試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號AD190124）；NGF ELISA 試劑盒（北京安迪華泰科技有限公司，批號AD190128）；TRizol ［寶日醫生物技術（北京） 有限公司］；RevertAid cDNA 逆轉錄試劑盒（美國Thermo 公司）；SYBR Green qPCR Kit （日本Toyobo 公司）；DEPC （美國Pierce 公司）。

1.3 儀器 多功能酶標儀 （美國Tecan 公司）；Nanodrop2000 紫外微量分光光度計（美國Thermo 公司）；Mastercycler pro 梯度PCR 儀（德國Eppendorf 公司）；LigthCycler480 熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；BL-420S 生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；穩豪倍優型血糖儀（OneTouchR UltraVue，美國強生公司）。

2 方法

2.1 造模 60 只SPF 級SD 大鼠在自然光線、自由飲食條件下適應性喂養7 d。正常組不造模，自由飲食、普通飼料喂養，其余3 組高脂飼料喂養2 個月后以鏈脲佐菌素造模，臨用前以0.1 mmol／L 枸櫞酸緩沖液（pH ＝4.2，4 ℃） 在避光條件下配成2%溶液。大鼠于高脂飼料喂養第61 天禁食12 h，左下腹腔單次注射鏈脲佐菌素（50 mg／kg），72 h后取尾靜脈血測隨機血糖，≥16.7 mmol／L 者為糖尿病造模成功。大鼠自由飲食7 d，第8 天測定坐骨神經運動神經傳導速度（Motor Conduction Velocity，MCV），較造模前下降≥10%為DPN 大鼠模型。

2.2 分組及給藥 分為正常組、模型組、給藥組、陽性對照組，每組10 只。正常組和模型組大鼠每日自由飲食，不予任何干預；陽性對照組大鼠腹腔注射甲鈷胺注射液（250 μg／kg），1 次／d；給藥組大鼠腹腔注射紅花黃色素（40 mg／kg，溶于0.9%氯化鈉注射液中），1 次／d。造模成功后于第1～28 天給藥，干預4 周。

2.3 血糖測定 大鼠尾靜脈采血，應用穩豪倍優型血糖儀及穩豪試紙檢測。

2.4 坐骨神經神經傳導速度測定 使用BL-420S 生物機能實驗系統。大鼠腹腔注射水合氯醛（35 mg／kg） 麻醉，俯臥位固定，將刺激雙針電極置于大鼠右側坐骨切跡處坐骨神經傳出部位，于同側踝關節坐骨神經經過部位用雙針電極記錄，參考電極置于刺激電極與記錄電極之間、距記錄電極1 cm 處。用波寬1 ms 的單刺激，延時10 000 ms，每2 個刺激之間間隔5 s 以上，記錄復合動作電位的峰-峰值作為波幅值，嚴格控制室溫（20±0.5） ℃，保持動物體溫37 ℃。計算機記錄刺激開始到動作電位出現的時間，即潛伏時間，將大鼠后足以自然肢體狀態與脊柱成45 °夾角向斜后方拉直，沿坐骨神經經過部位和方向，在體表準確測定刺激電極到記錄電極之間的距離。MCV ＝刺激電極與記錄電極間的距離／潛伏時間。

2.5 血清相關指標測定 采用ELISA 法。把SOD、MDA、NGF 抗體包被在96 孔微孔板里，做成固相載體，朝微孔中分別加入標準品或標本，其中SOD、MDA、NGF 與結合于固相載體上的抗體結合，然后加入生物素化的SOD、MDA抗體，把未結合的生物素化抗體洗凈，再加入HRP 標記的親和素，再徹底洗漆1 次后加入TMB 底物顯色；TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并且在酸的作用下轉化為最終的黃色，其深淺與SOD、MDA、NGF 呈正相關。酶標儀檢測450 nm 波長處光密度（OD），計算因子水平，具體操作根據試劑盒說明書嚴格執行。

2.6 RT-PCR 檢測坐骨神經組織NGFmRNA 表達 取大鼠坐骨神經（長度不小于5 mm），以液氮研磨組織粉末，氯仿-異丙醇法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度和有無降解。按照逆轉錄試劑盒操作合成cDNA。以cDNA為模板，按照ABI Prism 7000 實時定量PCR 儀操作規程檢測，進行擴增，檢測mRNA 表達用儀器配套的SDS1.1 軟件分析，內參選擇GAPDH。引物序列：NGF正向5′-CAACAGGACTCACAGGAGCAAGC-3′，反向 5′-GATGTCCGTGGCTGTGGTCTTATC -3′；GAPDH正向 5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′，反向 5′-TGAACTTGCCGTGGGTAGAG-3′。每個樣本、指標重復3 次。

2.7 統計學分析 采用SPSS 15.0 軟件進行處理，數據以（） 表示，滿足正態性和方差齊性，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗；不滿足正態分布，采用Wilcoxon 秩和檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 紅花黃色素對DPN 大鼠坐骨神經MCV 的影響 在藥物干預前與正常組比較，DPN 大鼠MCV 降低（P＜0.05）。在藥物干預后，模型組MCV 較正常組下降（P＜0.01）；與模型組比較，紅花黃色素給藥組大鼠MCV 升高（P＜0.01），提示注射用紅花黃色素可能具有延緩DPN 大鼠MCV 下降的作用，見表1。

表1 紅花黃色素對DPN 大鼠坐骨神經MCV 的影響（m／s，， n＝10）

表1 紅花黃色素對DPN 大鼠坐骨神經MCV 的影響（m／s，， n＝10）

注：與正常組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 紅花黃色素對DPN 大鼠SOD、MDA、NGF 的影響DPN 大鼠SOD 水平低于正常大鼠（P＜0.01），MDA 水平高于正常大鼠（P＜0.01），提示DPN 的發生、發展與氧化應激有關。與模型組比較，給藥組及陽性對照組SOD、NGF 水平升高，MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），見表2。與正常組比較，模型組NGFmRNA 表達降低 （P＜0.01）；與模型組比較，給藥組NGFmRNA 表達升高（P＜0.01），見圖1。

表2 紅花黃色素對DPN 大鼠血清SOD、MDA、NGF 水平的影響（， n＝10）

表2 紅花黃色素對DPN 大鼠血清SOD、MDA、NGF 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 討論

DPN 與OS 關系密切，國外內的研究均發現DPN 患者體內的MDA 顯著升高、SOD 顯著下降［11-12］，提示DPN 的發生、發展與SOD 水平下降、MDA 水平上升有關。OS 可導致雪旺細胞損傷［13-14］，從而引起內源性NGF 合成和分泌障礙。NGF 表達下降與DPN 的發生和發展存在密切聯系。

圖1 紅花黃色素對DPN 大鼠坐骨神經組織NGF mRNA表達的影響

糖尿病的臨床表現為口干多飲、多食易饑、多尿、消瘦，屬中醫學“消渴病”范疇。DPN 的臨床表現為肢體麻木、疼痛、冰涼、乏力等各種感覺異常，屬于中醫學“痹癥”范疇。由于其與消渴病關系密切，是患消渴病日久、病情遷延所致的“變證”，故現代中醫學將DPN 稱為“消渴病痹癥”。消渴病痹癥之候輕者表現為肢端麻木不仁，重者表現為痛如針刺、痛有定處，其特點與瘀血內生、經絡不通所致之疼痛特點相符。因此，運用中醫藥治療DPN應以活血化瘀為基本治法。中藥紅花首載于《新修本草》，性溫，味辛，具活血通經、祛瘀止痛之功［15］。注射用紅花黃色素是紅花的主要活性成分［16］。既往研究發現紅花黃色素具有擴張動脈、抗凝、抗氧化等作用［17-19］。

本研究發現，接受注射用紅花黃色素腹腔注射4 周后，糖尿病大鼠坐骨神經MCV 有上升，但與給藥前對比，差異未存在統計學意義，未能證實注射用紅花黃色素具有逆轉高血糖引起神經功能損傷。但在干預后，給藥組MCV 優于模型組，提示注射用紅花黃色素能延緩DPN 進展。本研究發現注射用紅花黃色素具有抗氧化應激、上調NGF 表達的作用；與模型組相比，注射用紅花黃色素組SOD、NGF 水平升高。本研究結果顯示，紅花黃色素可減輕高血糖引起的氧化應激，延緩神經組織中NGF 表達下降，從而發揮保護神經組織的作用。