UPLC-MS／MS 法分析通奶草乙酸乙酯部位成分及其體外抗菌活性

林啟凰，鮑紅娟，張 崗*

（1.廈門醫學院，廈門市海洋天然產物資源重點實驗室，福建廈門 361023； 2.廈門醫學院閩臺青草藥研究室，福建廈門 361023）

大戟科大戟屬植物是被子植物的一個龐大家族，全世界有2 000 種以上［1］，《中國植物志》 記載該屬植物有80種［2］，部分是臨床上常見中藥，如大戟、狼毒、甘遂、飛揚草等，在民間應用也十分普遍，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等藥理活性［3］。通奶草Euphorbia hypericifoliaL.為大戟屬聚生花序組植物［4］，廣泛分布于我國長江以南各省，具有清熱利濕、收斂止癢的功效［3］，可用于治療腹瀉及瘙癢性皮膚病，主要含有黃酮、鞣花酸、三萜、甾體類物質［5］，但其藥理活性評價未見報道。課題組前期發現，通奶草乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑制作用，為了進一步發掘其藥用價值，本實驗利用超高效液相色譜-串聯質譜聯用技術（UPLC-MS／MS） 對其乙酸乙酯萃取物成分進行分析，共鑒定出21 種，包括3 種有機酸、8 種可水解鞣質、10 種黃酮，除鞣花酸和槲皮素外均為首次從該植物中鑒定。

1 材料

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀［Waters 科技（上海） 有限公司］；Q Exactive Focus 組合型四極桿Orbitrap 質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Diaion MCI樹脂（日本三菱化學公司）。沒食子酸、鞣花酸、異槲皮苷、木犀草苷、紫云英苷、槲皮素對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；瑞諾苷、番石榴苷、juglalin 對照品均購自成都普利斯生物科技有限公司；金絲桃苷［6］、柯里拉京［7］、老鸛草素［7］對照品為實驗室自制。MH 瓊脂培養基（北京陸橋技術有限責任公司）；MH 液體培養基（廣東環凱生物科技有限公司）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌標準菌株由廈門醫學院病原微生物與免疫學實驗室提供；氨芐青霉素、諾氟沙星藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）。藥材于2018 年10 月采自福建廈門市灌口鎮，經廈門醫學院藥學系鮑紅娟副教授鑒定為大戟科大戟屬植物通奶草Euphorbia hypericifoliaL.的地上部分。

2 方法

2.1 樣品溶液制備 取通奶草地上部分50 g （干重） 粉碎成粗粉，分別用10 倍量75%甲醇加熱回流提取2 次，每次2 h，濾過，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，加入適量水混旋后，依次用等量的石油醚、乙酸乙酯各萃取3 次，合并萃取液，減壓蒸干得總萃取物（2.5 g），取適量過MCI樹脂，90%甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓干燥，適量甲醇溶解，即得（1 mg／mL）。

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫25 ℃；流動相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫 （0～50 min，5%～30% B；50～51 min，30%～100%B；51～57 min，100%～100%B；體積流量0.4 mL／min；全波長掃描；進樣量2.5 μL。

2.3 質譜條件 電噴霧電離源負離子檢測模式，輔助氣體積流量5 L／min；噴霧電壓2.00 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；掃描模式Full MS／dd-MS2，m／z100～1 500；二級質譜碰撞能量-30 eV。

2.4 抗菌實驗

2.4.1 抑菌圈測定［8］取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌標準菌株（-80 ℃超低溫保存），活化后挑取單菌落接種于100 mL MH 肉湯培養基中，37 ℃下搖瓶培養24 h，最后將菌液調整至約1.5×108CFU／mL 的含菌量。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的陽性對照品分別為氨芐青霉素、諾氟沙星藥敏紙片，空白對照為甲醇和活化菌液。將各活化菌液用滅菌棉簽均勻鋪于MH 瓊脂培養基板上，用鑷子夾取直徑6 mm 的無菌濾紙片放在平板中，貼緊MH固體培養基表面，吸取2 mg／mL 樣品溶液10 μL 滴于濾紙上，陽性藥敏紙片同法貼于培養基表面，待甲醇揮干后密封，于37 ℃培養箱中靜置24 h 后觀察。

2.4.2 最小抑菌濃度測定［9］采用96 孔板法，每孔培養體系為200 μL，含有MH 液體培養液180 μL、不同質量濃度的待測樣品10 μL、菌液10 μL。測試前配制樣品溶液，并稀釋成2、1.8、1.6、1.4、1、0.8 mg／mL。用空白培養基和甲醇溶液作對照，吸取稀釋好的待測樣品10 μL，置于已加入180 μL 培養液的96 孔板中，加入菌液10 μL，密封，于37 ℃培養箱中靜置24 h 后觀察并計算MIC 值。

公式為MIC （μg／mL） ＝ （V1×C×1 000） ／V2，其中V1為待測樣品體積（μL），V2為體系總體積（μL），C為使培養液澄清的最低待測溶液質量濃度（mg／mL）。

3 結果

經預實驗結合同屬植物化學成分報道，推斷通奶草主要成分可能為酚類，故采用負離子模式采集總離子流數據，結果見圖1、表1。根據離子流出峰的相對保留時間、準分子離子的精確質荷比、碎片離子信息，同時參照文獻數據，最終鑒定出21 種成分，包括3 種有機酸、8 種可水解鞣質、10 種黃酮，結合相關對照品信息，鑒定了沒食子酸（1）、柯里拉京（5）、老鸛草素（6）、鞣花酸（11）、金絲桃苷（12）、異槲皮苷（13）、木犀草苷（14）、瑞諾苷（15）、番石榴苷（16）、紫云英苷（17）、juglalin （20）、槲皮素（21），除鞣花酸和槲皮素外均首次從該植物中鑒定。體外抗菌實驗顯示，通奶草乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有一定的的抑制作用。具體如下。

圖1 通奶草乙酸乙酯萃取部位負離子檢測模式下總離子流圖

3.1 化合物鑒定

3.1.1 沒食子酸類 化合物1 （tR＝6.00 min） 的準分子離子峰為m／z169.013 3 ［M-H］-，根據元素組成，推測分子式為C7H6O5，二級碎片離子m／z125.023 1 ［M-H-CO2］-是由為分子中失去一個質子和一個中性碎片CO2產生，根據對照品的相關信息，鑒定化合物1 為沒食子酸。化合物2 （tR＝18.05 min） 的準分子離子峰為m／z183.029 1 ［MH］-，根據元素組成，推測分子式為C8H8O5，二級碎片離子m／z168.005 4 ［M-H-·CH3］-是由為分子中失去1 個質子和1 個甲基自由基·CH3產生，初步鑒定化合物2 為沒食子酸甲酯［10］。

3.1.2 沒食子酸鞣質 化合物3、7、10 的二級質譜均有m／z169 ［M-H］-特征信號，且為基峰，提示分子中均有沒食子酰基；其碎片離子在準分子離子峰基礎上連續失去沒食子酰基 （-galloyl，152 u）［11］，也可能失去中性碎片H2O。以化合物10 （tR＝33.92 min） 為例，準分子離子峰為m／z787.100 1 ［M-H］-，根據元素組成，推測分子式C34H28O22，二級質譜顯示了635.090 8 ［M-H-galloyl］-、617.080 9 ［M-H-galloyl-H2O］-、483.078 0 ［M-H-2galloyl］-、465.067 3 ［M-H-2galloyl-H2O］-、169.013 2［GA］-等特征碎片離子信息，根據文獻［12］鑒定為四沒食子酰基葡萄糖苷。同理，化合物3 （tR＝24.43 min）、7（tR＝28.41 min） 的準分子離子峰分別為m／z635.089 9、635.089 7 ［M-H］-，根據碎片離子信息和文獻［12］鑒定均為三沒食子酰基葡萄糖苷（同分異構體）。

3.1.3 鞣花酸及鞣花鞣質 化合物11 （tR＝34.80 min）的準分子離子峰為m／z300.998 8 ［M-H］-，根據元素組成，推測分子式為C14H6O8，特征碎片離子有m／z283.305 4［M-H-H2O］-、257.008 5 ［M-H-CO2］-。根據碎片離子和對照品的相關信息，鑒定為鞣花酸。

化合物4～6、8～9 鑒定為鞣花鞣質，分子中均有六羥基聯苯二甲酸結構，二級質譜均出現m／z301 ［M-H］-［13］，且為基峰，其碎片離子可能失去沒食子酰基或中性碎片H2O。該類化合物另一個典型特征是一級質譜上易見［M-2H］2-峰［14］。以化合物5 （tR＝26.60 min）、6 （tR＝27.11 min） 為例，化合物5 準分子離子峰為m／z633.074 5［M-H］-，根據元素組成，推測分子式C27H22O18，二級質譜顯示了615.063 0 ［M-H-H2O］-、463.051 9 ［M-Hgalloyl-H2O］-、300.999 3 ［ellagic acid］-、169.013 4［GA］-等特征性碎片離子信息，根據文獻［15］并結合對照品質譜和色譜信息，鑒定為柯里拉京；化合物6 準分子離子峰為m／z951.076 2 ［M-H］-，根據元素組成，推測分子式C41H28O27，二級質譜顯示了475.034 1 ［M-2H］2-特征性碎片離子，以及933.064 6 ［M-H-H2O］-、933.053 1 ［M-HH2O］-、475.034 1 ［M-2H］2-、300.999 1 ［ellagic acid］-、169.012 9 ［GA］-等特征性碎片離子信息，根據文獻［15］結合對照品質譜和色譜信息，鑒定為老鸛［12］草素。同理，

鑒定化合物4、8、9 分別為chebulanin［16］、digalloyl-HHDPglucose、chebulagic acid［12］。

表1 通奶草乙酸乙酯部位化學成分鑒定

3.2 黃酮類化合物鑒定

3.2.1 槲皮素類 負離子模式下，黃酮醇苷的ESI 串聯質譜中易形成［M-H］-分子離子峰，脫去糖基形成苷元離子［Y0］-，也可以均裂方式形成［Y0-H］-·自由基負離子［17］，后者在3-O 取代黃酮中極易形成［18］。化合物12～13、15～16 鑒定為以槲皮素為母核的黃酮苷，二級質譜均顯示了槲皮素母核的特征信號為m／z301 為 ［Y0］-，m／z300 為［Y0-H］-·，后者為基峰，說明可能為3-O取代黃酮苷；m／z271 為［Y0-H2CO］-碎片離子，m／z151 為RDA 裂解產生的碎片離子。化合物12 （tR＝35.18 min） 準分子離子峰為m／z463.088 5 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個己醛糖基，推斷3-O上連有己醛糖；化合物13 （tR＝35.91 min）準分子離子峰為m／z463.088 4 ［M-H］-，與苷元m／z301相比少了一個己醛糖基，推斷3-O上也連有己醛糖，根據對照品的相對保留時間和質譜信息，鑒定12 為槲皮素-3-Oβ-吡喃半乳糖苷，即金絲桃苷；13 為槲皮素-3-O-β-吡喃葡萄糖苷，即異槲皮苷。化合物15 （tR＝37.46 min） 準分子離子峰為m／z433.077 8 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個戊醛糖基，推斷3-O上連有戊醛糖；16 （tR＝38.31 min） 準分子離子峰為m／z433.077 6 ［M-H］-，與苷元m／z301 相比少了一個戊醛糖基，推斷3-O上也連有戊醛糖，根據對照品的相對保留時間和質譜信息，鑒定化合物15 為槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖苷，即瑞諾苷；16 為槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，即番石榴苷。根據準分子離子峰、碎片離子和對照品信息，鑒定化合物21 （tR＝53.39 min） 為槲皮素。

3.2.2 山柰酚類 化合物17、19～20 鑒定為以山柰酚為母核的黃酮苷，二級質譜均顯示其特征信號為m／z285 為［Y0］-，m／z284 為［Y0-H］-·，后者為基峰，說明可能為3-O取代黃酮苷；m／z255 為［Y0-H2CO］-碎片離子，m／z151 為RDA 裂解產生的碎片離子。化合物17 （tR＝39.86 min） 準分子離子峰為m／z447.093 5 ［M-H］-，與苷元m／z285 相比少了一個己醛糖基，推斷3-O上連有己醛糖，根據對照品的相對保留時間和質譜信息，鑒定為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，即紫云英苷。化合物19 （tR＝41.50 min） 和20 （tR＝42.43 min） 為同分異構體，準分子離子峰均為m／z417 ［M-H］-，與苷元m／z285 相比均少了一個戊醛糖基，推斷3-O上連有戊醛糖，根據對照品相對保留時間和質譜信息，鑒定20 為山柰酚-3-O-α-阿拉伯糖苷，即juglalin；根據同屬植物化學成分報道和相對保留時間［19-20］，初步鑒定19 為山柰酚-3-O-β-D-吡喃木糖苷。

3.2.3 其他黃酮 在實驗條件下，未實現化合物14 （tR＝35.98 min） 與15 的色譜分離，一級質譜上顯示了m／z447.093 5 ［M-H］-準分子離子峰，與化合物17 互為同分異構體，但卻顯示了與17 不同的質譜數據。表1 顯示，基峰m／z285 為［Y0］-，提示黃酮分子3 位氫未被取代，可能為木犀草素母核，此外還顯示了m／z327.050 8 的碎片離子峰，與文獻［21］報道一致。結合對照品信息，鑒定化合物14 為木犀草苷。化合物18 （tR＝40.90 min） 準分子離子峰為m／z417.083 5 ［M-H］-，根據元素組成推測分子式為C21H20O10，碎片離子顯示了m／z269 ［Y0］-的芹菜素母核信息，初步鑒定為芹菜素-7-O-β-吡喃葡萄糖苷［21］。

3.3 抗菌活性 結果見圖2。在質量濃度為2 mg／mL時，通奶草乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為（9±0.2） mm ［陽性對照為（31±0.2） mm］，見圖2A；對大腸桿菌為（8±0.3） mm ［陽性對照為（30±0.3） mm］，見圖2B；MIC 值分別為90、100 μg／mL，表明萃取物對兩者具有一定的抑制作用。

圖2 通奶草乙酸乙酯萃取物抗菌活性實驗

4 討論

LC-MS／MS 聯用技術用于復雜天然成分分析，具有快速、高效、靈敏等特點［22］，是研究中草藥等天然藥物的有力工具。本研究采用UPLC-MS／MS 聯用技術，結合對照品對照，鑒定了通奶草乙酸乙酯萃取物的21 種成分，以可水解鞣質和黃酮類化合物為主，基本闡明通奶草乙酸乙酯萃取部位的成分組成。通奶草中所含化合物類型及種類與同屬植物地錦草［19］及同科植物烏桕［23］等相似，表明同科特別是同屬植物之間的化學成分存在共性，這對于開發藥用資源具有重要意義。本研究所鑒定的諸多化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病原微生物、降血糖等多種生物活性，對于揭示通奶草藥效物質基礎具有一定意義。沒食子酸對早幼粒細胞白血病（HL-60RG）、人胃癌細胞（KATOⅢ）和結腸腺癌細胞（COLO 205） 均有抑制作用［24］；老鸛草素對單純皰疹病毒（HSV-1 和HSV-2） 具有顯著抑制活性［25］；鞣花酸對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用，其作用機制可能與抗炎和抗氧化有關［26］；金絲桃苷能有效抑制COX-2 蛋白表達，逆轉炎癥因子對肝細胞造成的損傷，進而保護肝細胞［27］；異槲皮苷（15 mg／kg） 可顯著降低四氧嘧啶升高的血糖濃度，其機制與6-葡萄糖磷脂酶活性抑制以及抗氧化清除自由基密切相關［28］，這些文獻報道為通奶草的臨床應用提供了理論依據。同時，乙酸乙酯萃取物對2 種常見的革蘭氏致病菌有一定的抑菌作用，對后續的研究有一定的借鑒意義。