化濁解毒疏肝方對抑郁癥模型小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用

曹亞飛張延紅趙亞男平 鑫秦少坤劉書寧裴 林

（1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050031； 2.華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063000； 3.河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北保定 071051； 4.河北省中醫(yī)藥科學(xué)院，河北石家莊 050031）

抑郁癥是以情緒低落、快感缺失、精力減退導(dǎo)致活動減少為主要表現(xiàn)的一種臨床綜合征［1］，2008 年，世界衛(wèi)生組織將其列為全球第三大負擔(dān)疾病，并預(yù)計在2030 年升至第一［2］，它可引起氣郁、血瘀、痰濁等物質(zhì)瘀積，遷延日久，濁化成毒。由于濁毒膠著難去，纏綿難愈，臨床上單用疏肝、活血、祛濕、化痰等單一方法難以奏效，故同時從化濁、解毒、疏肝多種途徑來治療抑郁癥在近些年頗受重視。化濁解毒疏肝方（HJSF） 是基于濁毒理論配制的方劑，本研究通過小鼠抑郁癥模型來探討該方改善學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)機制。

1 材料

1.1 動物 8 周齡雄性ICR 小鼠48 只，SPF 級，體質(zhì)量27～33 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK （冀） 2018-004。

1.2 試劑與藥物 化濁解毒疏肝方由柴胡12 g、絞股藍12 g、石菖蒲9 g、黃芩12 g、荷梗9 g、羅勒6 g 組成，藥材由安國市遠光藥業(yè)有限公司、安國市伊康藥業(yè)有限公司提供 （批號236190702、307190901、352190702、302190807、180901、180601），經(jīng)河北省中醫(yī)藥科學(xué)院王小剛工程師鑒定為正品，加10 倍量水浸泡1 h，煎煮2 次，每次30 min，合并濾液，濃縮至2、1、0.5 g 生藥／mL，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩｛}酸氟西汀膠囊（禮來蘇州制藥有限公司，貨號J20170022）；兔抗GAP-43 單克隆抗體 （英國Abcam 公司，貨號ab75810）；小鼠抗NCAM1 單克隆抗體（英國Abcam 公司，貨號ab9018）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號ZB2301）；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠lgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號ZB2305）；RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司，貨號R0020）；PVDF 膜（美國Milliporego 公司，貨號IPVH00010）。

1.3 儀器 22331 Hamburg 蛋白濃度定量儀（德國Eppendorf 公司）；WSE-4040 半干轉(zhuǎn)模儀（日本ATTO 公司）；centrifuge5417R 低溫高速離心（德國Eppendorf 公司）；超純水儀（北京康銘泰克科技發(fā)展有限公司）；DYCZ-24DN 電泳儀（北京六一儀器廠）；TS-8 轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；Tanon1 600 分析儀器（上海天能科技有限公司）；Morris 水迷宮（北京碩林苑科技有限公司）；RM2245 切片機 （德國Leica 公司）；CX41 生物顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 造模 小鼠正常飼養(yǎng)1 周后，構(gòu)建慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS） 模型，包括14 種刺激，即晝夜顛倒24 h、禁食24 h、禁水24 h、夾尾1 min、異物（水瓶、破布、廢紙） 24 h、異味（大蒜、酒精、香菜） 24 h、冰水游泳5 min、熱水游泳（45 ℃） 5 min、噪音 （80 db） 2 h、搖晃（120 rPm） 5 min、潮濕（潮濕度80%） 24 h、束縛2 h、傾斜（45°） 24 h、空籠24 h，每天給予2種不同刺激，每周每天刺激不重復(fù)，持續(xù)21 d。

2.2 分組及給藥 根據(jù)隨機數(shù)字表法將小鼠分為正常組、模型組、氟西汀組及化濁解毒疏肝方低、中、高劑量組，每組8 只，造模和給藥同時進行。小鼠體質(zhì)量測量分別于造模第0、7、14、21 天進行；根據(jù)人鼠體表面積換算比例，化濁解毒疏肝方低、中、高劑量組灌胃劑量分別為0.85、1.7、3.4 g／kg，氟西汀組為10 mg／kg，正常組、模型組灌胃生理鹽水 （15 mL／kg），每天1 次，持續(xù)21 d。

2.3 糖水偏好實驗 本實驗參考Mesripour［3］報道的方法。造模結(jié)束后進行糖水偏好實驗，糖水偏好分數(shù)＝糖水消耗／總液體消耗。

2.4 水迷宮實驗 本實驗參考Mikulecká［4］報道的方法。給藥第17 天進行為期6 d 的適應(yīng)性訓(xùn)練；第23 天將平臺拆除，記錄小鼠穿越平臺原來所在位置的次數(shù)；第24 天將原來平臺旋轉(zhuǎn)180 度，記錄小鼠找到平臺的潛伏期。

2.5 Western blot 檢測 行為學(xué)實驗結(jié)束后，取小鼠腦組織于冰上剝離海馬，稱定質(zhì)量，置于凍存管中，-80 ℃冰箱中保存。取100 mg 組織，剪碎后放入液氮中，研磨至細粉末狀，裝入離心管，加入裂解液，4 ℃冰箱中過夜，4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，取上清液。根據(jù)定量結(jié)果，把同體積的蛋白樣品混合在蛋白質(zhì)上樣緩沖液中，95 ℃下變性10 min。在凝膠孔中加入蛋白質(zhì)樣品，打開電泳儀，電壓為50 V，樣品通過濃縮膠與分離膠，目的條帶跑到分離膠2／3 左右位置時停止電泳。將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，非標記的一抗4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗37 ℃搖床孵育1 h，應(yīng)用Tanon Gis 軟件進行灰度值的分析。

2.6 免疫組化檢測 小鼠腦組織用4%甲醛固定，經(jīng)過石蠟包埋、切片、脫蠟脫水、檸檬酸抗原緩沖液修復(fù)、滴加抗體、DAB 顯色、脫水透明、封片等步驟后，于顯微鏡下觀察海馬細胞CA3 區(qū)NCAM 和GAP-43 的表達，通過Image-Proplus 軟件進行分析。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進行分析，定量資料以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，方差不齊時采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 化濁解毒疏肝方對小鼠糖水偏好分數(shù)的影響 如表1 所示，模型組糖水偏好分數(shù)低于正常組（P＜0.01）；化濁解毒疏肝方高、中劑量組和氟西汀組（P＜0.01），以及化濁解毒疏肝方低劑量組（P＜0.05） 均高于模型組。

表1 化濁解毒疏肝方對小鼠糖水偏好分數(shù)的影響（，n＝8）Tab.1 Effects of HJSF on sugar preference scores in mice（， n＝8）

表1 化濁解毒疏肝方對小鼠糖水偏好分數(shù)的影響（，n＝8）Tab.1 Effects of HJSF on sugar preference scores in mice（， n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 化濁解毒疏肝方對小鼠體質(zhì)量的影響 如表2 所示，第14 天模型組小鼠體質(zhì)量低于正常組（P＜0.01），化濁解毒疏肝方高劑量和氟西汀組高于模型組 （P＜0.01）；第21 天，模型組小鼠體質(zhì)量小于正常組（P＜0.01），化濁解毒疏肝方高劑量組（P＜0.01）、中劑量組 （P＜0.05） 高于模型組。

表2 化濁解毒疏肝方對小鼠體質(zhì)量的影響（g，， n＝8）Tab.2 Effects of HJSF on body mass in mice （g，， n＝8）

表2 化濁解毒疏肝方對小鼠體質(zhì)量的影響（g，， n＝8）Tab.2 Effects of HJSF on body mass in mice （g，， n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 化濁解毒疏肝方對小鼠水迷宮穿越平臺次數(shù)和反向站臺潛伏期的影響 如表3 所示，模型組小鼠穿越平臺次數(shù)少于正常組（P＜0.01），化濁解毒疏肝方高劑量組（P＜0.01）、氟西汀組（P＜0.05）多于模型組；模型組小鼠反向站臺潛伏期長于正常組（P＜0.01），化濁解毒疏肝方高、中劑量組和氟西汀組小鼠反向站臺潛伏期短于模型組 （P＜0.01）。

表3 化濁解毒疏肝方對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（， n＝8）Tab.3 Effects of HJSF on learning and memory in mice （，n＝8）

表3 化濁解毒疏肝方對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（， n＝8）Tab.3 Effects of HJSF on learning and memory in mice （，n＝8）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 化濁解毒疏肝方對小鼠海馬組織中NCAM、GAP-43 蛋白表達的影響 如圖1 所示，模型組的NCAM、GAP-43 表達低于正常組（P＜0.01），氟西汀組及化濁解毒疏肝方組高于模型組 （P＜0.01）。免疫組化結(jié)果也顯示，模型組小鼠海馬CA3 區(qū)NCAM、GAP-43 表達低于正常組 （P＜0.05），氟西汀組、化濁解毒疏肝方高劑量組高于模型組（P＜0.05），見圖2～3、表4。

圖1 Western blot 檢測各組小鼠海馬NCAM、GAP-43 蛋白表達（n＝3）Fig.1 Detection of NCAM and GAP-43 protein expressions in mice hippocampus in each group by Western blot （n＝3）

圖2 免疫組化檢測各組小鼠海馬CA3 區(qū)NCAM 表達（×400）Fig.2 Detection of NCAM expression in mice hippocampal CA3 region in each group by immunohistochemical （×400）

圖3 免疫組化檢測各組小鼠海馬CA3 區(qū)GAP-43 表達（×400）Fig.3 Detection of GAP-43 expression in mice hippocampal CA3 region in each group by immunohistochemical （×400）

表4 各組小鼠海馬CA3 區(qū)NCAM、GAP-4 表達的免疫組化結(jié)果（， n＝3）Tab.4 Immunohistochemical results for the expressions of NCAM and GAP-4 in CA3 area of mice hippocampus in each group （， n＝3）

表4 各組小鼠海馬CA3 區(qū)NCAM、GAP-4 表達的免疫組化結(jié)果（， n＝3）Tab.4 Immunohistochemical results for the expressions of NCAM and GAP-4 in CA3 area of mice hippocampus in each group （， n＝3）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

4 討論

CUMS 應(yīng)激模型是經(jīng)典的抑郁癥動物模型，經(jīng)過大量實驗被證明穩(wěn)定可靠［5-7］。糖水偏好實驗?zāi)苣M抑郁癥的臨床癥狀，小鼠偏愛甜食，模型組小鼠由于快感缺乏，蔗糖溶液攝入量下降，糖水偏好分數(shù)低于化濁解毒疏肝方組，這與前期報道一致［8-9］。研究報道，CUMS 應(yīng)激小鼠體質(zhì)量增長緩慢［10-11］；本實驗結(jié)果顯示，第1 周除了正常組，其余各組小鼠受造模的影響體質(zhì)量均有減輕；第2周各組小鼠體質(zhì)量均有緩慢的增長，其中模型組小鼠最為緩慢；第3 周造模結(jié)束后各組小鼠體質(zhì)量均有增長，但模型組仍低于化濁解毒疏肝方組。水迷宮是通過強迫實驗動物游泳，使其尋找隱于水中的平臺，主要包括定位航行實驗、空間探索實驗和反向站臺實驗，檢測對空間位置感覺和方向感覺的學(xué)習(xí)記憶能力。本實驗結(jié)果顯示，化濁解毒疏肝方組小鼠穿越平臺次數(shù)明顯多于模型組，而反向站臺的潛伏期顯著縮短，表明該方可以改善抑郁癥小鼠的學(xué)習(xí)記憶。

抑郁癥在中醫(yī)屬于“郁癥”范疇，郁可以影響氣機的升降，日久可導(dǎo)致氣、血、痰、濕、火的瘀積，郁而不化則成濁，濁久熏蒸則成毒。化濁解毒疏肝方依據(jù)濁毒理論，通過化濁、解毒、疏肝等多種途徑治療抑郁癥，同時改善學(xué)習(xí)記憶能力，方中柴胡主要起到疏肝理氣的作用，黃芩、羅勒起到化濕解毒的作用，而絞股藍、荷梗、石菖蒲起到了芳香化濁的作用。

海馬在學(xué)習(xí)記憶中起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中的3%大腦暴露七氟醚6 h 可導(dǎo)致海馬突觸可塑性損傷，學(xué)習(xí)記憶能力受損［12］。抑郁癥導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)功能損傷，其在八臂迷宮中工作記憶錯誤和參考記憶錯誤增加［13］。21 d 的慢性應(yīng)激后，應(yīng)激組動物海馬齒狀回LTP 的形成受到明顯的抑制，反應(yīng)動物空間學(xué)習(xí)記憶的水迷宮實驗成績明顯下降［14］。本研究主要觀察海馬區(qū)的變化，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠成績比化濁解毒疏肝方組差，同時化濁解毒疏肝方組NCAM、GAP-43 的蛋白表達明顯高于模型組，與前期報道一致［15-16］。

NCAM 在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和可塑性中起著重要作用，它不僅在發(fā)育過程中參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組織，而且在成熟的大腦中參與軸突的修飾，通過調(diào)節(jié)細胞間黏附能力和細胞間距進一步影響細胞活力，既參與神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成與維持，也參與神經(jīng)細胞信號傳遞的過程，在突觸可塑性中發(fā)揮作用，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。有研究表明，NCAM 通過纖維介素蛋白（FGL） 激活成纖維生長因子受體（FGFR1），增強突觸前功能，促進突觸形成，從而改善長期記憶［17］，它及其多唾液酸狀（PSA-NCAM） 在空間學(xué)習(xí)誘導(dǎo)的突觸重構(gòu)和記憶的存儲中起著重要的作用［18］，NCAM 缺陷的小鼠可導(dǎo)致大腦區(qū)域環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB） 介導(dǎo)的信號通路失調(diào)，表現(xiàn)出多個海馬突觸的長期可塑性受損，空間學(xué)習(xí)中斷，學(xué)習(xí)記憶能力下降［19］。GAP-43 是神經(jīng)細胞膜上特異性的磷蛋白，其主要作用包括促進神經(jīng)的生長發(fā)育和軸突的再生、調(diào)節(jié)突觸的形態(tài)、維持建立其功能和傳導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶信號，有研究表明，突觸蛋白GAP-43 缺失會導(dǎo)致小鼠腦功能的障礙，損害小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的能力［20］；還有資料顯示，適度磷酸化的GAP-43 蛋白表達可以增強記憶，但過度表達反而可能會損害記憶［21］。經(jīng)過化濁解毒疏肝方治療后，小鼠NCAM、GAP-43 蛋白表達明顯高于模型組，學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯改善。

綜上所述，化濁解毒疏肝方可明顯減輕CUMS誘導(dǎo)的抑郁樣行為和認知能力損害，增加了NCAM、GAP-43 蛋白表達，表明該方具有抗抑郁作用，可能與上調(diào)兩者表達有關(guān)，但具體仍有待進一步研究。