茶藨子葉狀層菌化學成分及其體外抗病毒活性

于秀玲，白麗君，李 琳，姚雅芳，李 巖，許俊杰，楊文強

（臨沂大學，山東臨沂 276000）

茶藨子葉狀層菌Phylloporia ribis（Lonicera japonicaThunb.） 為銹革孔菌科葉狀層菌屬藥食兩用真菌，該菌常寄生于生長年限較長的忍冬藤植株上，資源分布廣泛，主產于山東、河南、湖南等忍冬藤種植區［1-2］，常用于治療咽炎、扁桃體炎、喉炎等上呼吸道感染疾病，臨床治療效果相當顯著，也能夠有效提高機體免疫力［3］。現代藥理研究表明，該菌提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等作用［4-5］。目前，從茶藨子葉狀層菌中分離鑒定的化學成分有甾醇類、萜類、有機酸、多糖等［6］，為進一步尋找其活性物質，課題組對其進行了化學成分及抗病毒活性研究。采用多種色譜分離方法從中分離得到9 個化合物，其中6 個為首次從該菌中發現，并對1～8 進行了體外抗流感病毒（H1N1）、抗單純皰疹Ⅰ型病毒（HSV-1）、抗呼吸道合胞病毒（RSV A2） 活性測試。

1 材料

DRX-500M 核磁共振儀（瑞士布魯克公司）；安捷倫1200 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Thermo Scientific Q Exactive Focus 質譜儀 （美國Thermo Fisher 公司）。硅膠薄層板、柱層析硅膠（青島海洋化工分廠）；聚糖凝膠Sephadex LH-20（上海安瑪西亞生物技術有限公司）。乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯，氯仿等試劑均為市售分析純。

茶藨子葉狀層菌采自山東省臨沂市平邑縣鄭城鎮金銀花種植區，經山東省農業科學院基因測序與臨沂大學許俊杰教授鑒定為茶藨子葉狀層菌Phylloporia ribis（Lonicera japonicaThunb.）。呼吸道合胞病毒（RSV，A2 stain）、單純皰疹Ⅰ型病毒（HSV-1，F stain）、流感病毒（H1N1） 宿主細胞分別為人喉癌上皮細胞（HEp-2）、非洲綠猴腎細胞（Vero）、狗腎細胞（MDCK），由暨南大學中藥及天然藥物研究所提供，細胞生長在含10 %胎牛血清（FBS） 的DMEM 培養基中，維持液是含2%FBS 的DMEM 培養基。

2 提取與分離

取茶藨子葉狀層菌10 kg，粉碎，75%乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，過濾后合并濾液，減壓濃縮得總浸膏316.3 g，加水混懸后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，回收溶劑后得到石油醚萃取物76.5 g、乙酸乙酯萃取物33.2 g、水萃取物190 g。取乙酸乙酯萃取物進行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯（99∶1、95∶5、90∶10、8∶2、1∶1、3∶7） 梯度洗脫，TLC 薄層檢識，得到6 個餾分（Fr.1～Fr.6）。Fr.1 經硅膠柱層析分離，得到化合物1 （1.2 g）；Fr.2、Fr.3 經硅膠、Sephadex LH-20分離，得到化合物2 （81 mg）、3 （23 mg）；Fr.4經硅膠、Sephadex LH-20 色譜分離，得到化合物4（42 mg）、5 （29 mg）、6 （17 mg）。取水萃取物15 g，經ODS、Sephadex LH-20 色譜分離，得到化合物7 （53 mg）、8 （12 mg）、9 （8.1 g）。

3 結構鑒定

化合物1：白色針狀晶體（氯仿）；HR-ESIMSm／z：397.346 7 ［M ＋H］＋，分子式C28H44O（C28H45O 理論值397.346 5）。1H-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：5.58 （1H，dd，J＝6.5，6.0 Hz，H-6），5.38～5.42 （1H，m，H-7），5.22 （1H，dd，J＝15.5，7.0 Hz，H-23），5.18 （1H，dd，J＝15.0，7.5 Hz，H-22），3.63～3.65 （1H，m，H-3），1.03 （3H，d，J＝7.0 Hz，H-21），0.94 （3H，s，H-19），0.92（3H，d，J＝7.0 Hz，H-28），0.84 （6H，d，J＝7.0 Hz，H-26，27），0.63 （3H，s，H-18）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：141.3 （C-8），139.8 （C-5），135.6 （C-22），132.0 （C-23），119.6 （C-6），116.3 （C-7），70.5 （C-3），55.8 （C-17），54.6（C-14），46.3 （C-9），42.9 （C-24），42.8 （C-13），40.8 （C-4），40.4 （C-20），39.1 （C-1），38.4 （C-12），37.0 （C-10），33.1 （C-25），32.0（C-2），28.3 （C-16），23.0 （C-15），21.1 （C-11），21.1 （C-21），20.0 （C-27），19.6 （C-26），17.6 （C-28），16.3 （C-19），12.0 （C-18）。以上數據與文獻 ［7］基本一致，故鑒定為 （3β，22E） -ergosta-5，7，22-trien-3-ol。

化合物2：白色固體 （氯仿）；HR-ESI-MSm／z：258.889 0 ［M-H］-，分子式 C7H4Cl4O2（C7H3Cl4O2理論值258.888 7）。1H-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：5.93 （1H，s，1-OH），3.87 （3H，s，4-OCH3）；13C-NMR （125 MHz，CDCl3）δ：147.4（C-4），146.1 （C-1），127.3 （C-2，6），118.9（C-3，5），60.9 （4-OCH3）。以上數據與文獻［8］基本一致，故鑒定為drosophilin A。

化合物3：無色晶體 （氯仿）；HR-ESI-MSm／z：197.080 8 ［M ＋H］＋，分子式 C10H12O4（C10H13O4理論值197.080 8）。1H-NMR （500 MHz，CDCl3）δ：14.02 （1H，s，-OH），6.06 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-4），5.92 （1H，d，J＝2.5 Hz，H-7），3.85 （3H，s，6-OCH3），3.82 （3H，s，5-OCH3），2.61 （3H，s，2-CH3）；13C-NMR （125 MHz，CDCl3）δ：203.1 （C-1），167.5 （C-3），166.1 （C-5），162.9 （C-6），106.0 （C-2），93.5 （C-4），90.7（C-7），55.5 （5，6-OCH3），32.9 （2-CH3）。以上數據與文獻［9］基本一致，故鑒定為crototropone。

化合物4：橙黃色晶體（甲醇）；HR-ESI-MSm／z：179.070 2 ［M ＋H］＋，分子式 C10H10O3（C10H11O3理論值179.070 3）。1H-NMR （500 MHz，CH3OD）δ：7.52 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-7），7.08 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.99 （1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-6），6.79 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.55 （1H，d，J＝16.0 Hz，H-8），2.33 （3H，s，H3-10）；13C-NMR （125 MHz，CH3OD）δ：201.6（C-9），150.0 （C-4），146.9 （C-5），146.8 （C-7），127.8 （C-1），124.7 （C-8），123.5 （C-2），116.6 （C-3），115.3 （C-6），27.0 （C-10）。以上數據與文獻［10］基本一致，故鑒定為（E） -3，4-二羥基苯亞甲基丙酮。

化合物5：白色固體 （甲醇）；HR-ESI-MSm／z：137.023 1 ［M-H］-，分子式 C7H6O3（C7H5O3理論值137.024 4）。1H-NMR （500 MHz，CH3OD）δ：9.69 （1H，s，-CHO），7.31 （1H，dd，J＝9.0，2.0 Hz，H-6），7.30 （1H，brs，H-2），6.91（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR （125 MHz，CH3OD）δ：193.1 （C-7），153.7 （C-4），147.2（C-3），130.8 （C-1），126.4 （C-6），116.2 （C-5），115.4 （C-2）。以上數據與文獻［11］基本一致，故鑒定為protocatechualdehyde。

化合物6：白色針晶 （甲醇）；HR-ESI-MSm／z：125.023 0 ［M-H］-，分子式 C6H6O3（C6H5O3理論值125.024 4）。1H-NMR （500 MHz，CH3OD）δ：7.43 （1H，d，J＝2.0 Hz，H-3），7.42（1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-5），6.79 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-6）；13C-NMR （125 MHz，CH3OD）δ：151.5 （C-4），146.1 （C-2），141.9 （C-1），124.0（C-6），117.9 （C-5），115.9 （C-3）。以上數據與文獻［12］基本一致，故鑒定為1，2，4-苯三酚。

化合物7：白色固體 （甲醇）；HR-ESI-MSm／z：268.104 0 ［M ＋H］＋，分子式C10H13N5O4（C10H14N5O4理論值268.104 0）。1H-NMR （500 MHz，CH3OD）δ：8.31 （1H，s，H-8），8.18 （1H，s，H-2），5.97 （1H，d，J＝6.5 Hz，H-1′），4.74（1H，t，J＝6.5 Hz，H-2′），4.59 （2H，s，-NH2），4.33 （1H，dd，J＝5.0，2.5 Hz，H-3′），4.17 （1H，q，J＝2.5 Hz，H-4′），3.89 （1H，dd，J＝12.5，2.5 Hz，H-5′a），3.75 （1H，dd，J＝12.5，2.5 Hz，H-5′b）；13C-NMR （125 MHz，CH3OD）δ：157.6（C-6），153.5 （C-2），150.7 （C-4），142.0 （C-8），121.0 （C-5），91.2 （C-1′），88.17 （C-4′），75.5 （C-2′），72.7 （C-3′），63.5 （C-5′）。以上數據與文獻［13］基本一致，故鑒定為腺嘌呤核苷。

化合物8：白色固體 （甲醇）。1H-NMR （500 MHz，D2O）δ：7.90 （1H，d，J＝8.0 Hz，H-6），5.94 （1H，d，J＝4.5 Hz，H-5′a），5.93 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-5′b），4.38 （1H，t，J＝5.0 Hz，H-2），4.26 （1H，t，J＝5.0 Hz，H-3′a），4.15～4.17（1H，m，H-4），3.94 （1H，dd，J＝13.0，3.0 Hz，H-5），3.83 （1H，dd，J＝13.0，4.5 Hz，H-3′b）；13C-NMR （125 MHz，D2O）δ：166.2 （C-4），151.7 （C-2），141.9 （C-6），102.3 （C-5），89.4（C-1′），84.2 （C-4′），73.7 （C-3′），69.4 （C-2′），60.8 （C-5′）。以上數據與文獻［14］基本一致，故鑒定為尿嘧啶核苷。

化合物9：無色晶體 （水）。1H-NMR （500 MHz，DMSO）δ：4.88 （d，J＝3.5 Hz，1H），4.71（d，J＝5.0 Hz，1H），4.69 （d，J＝5.0 Hz，1H），4.53 （d，J＝6.0 Hz，1H），4.30 （t，J＝6.0 Hz，1H），3.64～3.66 （m，1H），3.54～3.58 （m，2H），3.45～3.49 （m，1H），3.22～3.26 （m，1H），3.11～3.16 （m，1H）；13C-NMR （125 MHz，DMSO）δ：93.1 （C-1），72.9 （C-3），72.4 （C-2），71.6 （C-5），70.1 （C-4），60.8 （C-6）。以上數據與文獻［15］基本一致，故鑒定為a-D-（＋） -葡萄糖。

4 抗病毒活性篩選

化合物對病毒宿主細胞的毒性實驗：將病毒宿主細胞以1×104／孔的濃度接種于96 孔板上，培養過夜形成單層細胞，培養液將化合物倍比稀釋至200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol／L，每個化合物3 個復孔，并設置不加藥物的細胞對照組，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h 后棄去培養基，每孔加入30 μL MTT 溶液，培養箱避光孵育4 h，隨后吸掉MTT，每孔加入200 μL DMSO 溶解生成的甲臜，并于搖板器上搖10 min，于酶標儀570 nm下檢測光密度（OD），計算細胞存活率，公式為存活率＝OD加藥組／OD細胞對照組×100%。

化合物體外抗HSV-1、RSV、H1N1 的活性評價：3 種病毒宿主細胞以2×104細胞／孔的濃度接種于96 孔板上，培養過夜形成單層細胞，以化合物的最大無毒濃度作為起始濃度，含2%血清的培養基倍半稀釋成6 個濃度，每孔加入50 μL 化合物，隨后加入100TCID50的病毒混懸液50 μL，同時設置陽性對照組（HSV-1 用阿昔洛韋對照組，RSV、H1N1 用利巴韋林對照組）、病毒對照組和細胞對照組，每組3 個復孔。細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，當病毒對照組出現“＋＋＋＋”（“-”表示無細胞病變，“＋”表示0～25%細胞發生病變，“＋＋”表示25%～50%細胞發生病變，“＋＋＋”表示50%～75%細胞發生病變，“＋＋＋＋”表示75%～100%細胞發生病變）、正常細胞對照組為正常時，記錄各孔的CPE，求出樣品對細胞病變的半數抑制濃度（IC50）。

表1 顯示，茶藨子葉狀層菌75%乙醇提取物表現出顯著的抗RSV A2、H1N1 活性，其IC50分別為10、100 μg／mL，但未表現出良好的抗HSV-1 病毒活性（利巴韋林抗RSV、H1N1 活性IC50分別為6.3、25 μmol／L，阿昔洛韋抗HSV-1 活性IC50為1.6 μmol／L）；石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水萃取物表現出抗RSV A2、H1N1 活性，其IC50分別為10、6、10、30、50 μg／mL及＞200 μg／mL。

表1 抗病毒實驗中各萃取物IC50值（μg／mL）Tab.1 IC50 values of various extracts in antiviral tests （μg／mL）

表2 顯示，化合物2 表現出抗RSV A2、HSV-1 活性，其IC50分別為50、75 μmol／L （利巴韋林抗RSV 活性IC50為6.3 μmol／L，阿昔洛韋抗HSV-1活性IC50為1.6 μmol／L）；化合物3 具有抗H1N1、RSVA2 的活性，其IC50分別為100、100 μmol／L（利巴韋林抗H1N1 活性IC50為25 μmol／L）；化合物4～5、7 表現出抗H1N1 活性，其IC50分別為12.5、12.5、25 μmol／L。

表2 抗病毒實驗中各化合物IC50值（μmol／L）Tab.2 IC50 values of various compounds in antiviral tests （μmol／L）

5 討論

本實驗對茶藨子葉狀層菌進行化學成分及抗病毒活性研究，其75% 乙醇提取物具有顯著的抗RSV A2、H1N1 活性，其 IC50分別為 10、100 μg／mL，但未表現出良好的抗HSV-1 病毒活性，從中分離鑒定了9 個化合物，其中6 個為首次從該菌中發現。采用CPE 抑制實驗對化合物進行了體外抗H1N1、抗HSV-1、抗RSV A2 活性研究，結果顯示化合物2 表現出抗RSV A2、HSV-1 活性，其IC50分別為50、75 μmol／L；化合物3 具有抗H1N1、RSV A2 的活性，其 IC50分別為100、100 μmol／L；化合物4～5、7 表現出較好的抗H1N1活性，其IC50分別為12.5、12.5、25 μmol／L，可知該菌具有顯著的抗RSV 病毒活性，從中分離的單體化合物也大多具有相同作用。本研究豐富了茶藨子葉狀層菌的藥效物質基礎，對其深度開發與利用具有指導意義。