川芎化學成分及其抑制子宮平滑肌收縮作用

馮 芮 郭 力 蒲忠慧劉 娟彭 成*熊 亮*

（1.成都中醫藥大學藥學院，教育部中藥材標準化重點實驗室，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都 611137； 2.成都中醫藥大學西南特色藥材創新藥物成分研究所，四川成都 611137； 3.成都醫學院檢驗醫學院，四川成都 610500）

川芎Ligusticum striatumDC.為傘形科藁本屬多年生草本植物，首載于《神農本草經》，其性辛、溫，歸肝、膽、心包經，具有祛風止痛、活血行氣之功效，臨床可用治頭痛、月經不調，經閉痛經等癥［1］，至今已從中分離鑒定出170 余種成分，主要包括苯酞、萜烯及其烯醇、生物堿、甾醇、有機酸及其酯類［2］、人參皂苷［3］等。然而，關于川芎化學成分的報道主要集中于極性較小的苯酞類，對于大極性的酚酸類、生物堿類研究較少，課題組前期對川芎總生物堿的提取和純化工藝進行了研究［4-5］，首次發現它對子宮平滑肌收縮具有顯著抑制作用［6］。目前，關于川芎生物堿抑制子宮平滑肌收縮的藥效物質研究較少，僅發現川芎嗪［7］對縮宮素所致正常雌性小鼠子宮平滑肌劇烈收縮具有明顯的拮抗作用，故本研究利用現代提取分離手段，從川芎中獲得8 種生物堿，并采用縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮模型考察它們對子宮平滑肌收縮活動的影響，發現化合物1～3 在50 μmol／L濃度下有顯著抑制作用。

1 材料

1.1 儀器 Rotavapor R-205 旋轉蒸發儀（瑞士Buchi 公司）；Agilent 1220 半制備型HPLC 色譜儀（美國Agilent 公司）。D101 大孔吸附樹脂（成都科龍化工試劑廠）；732 型陽離子交換樹脂（河北華偉樹脂廠）；柱層析硅膠（200～300 目）、薄層層析硅膠GF254（青島海洋硅膠干燥劑廠）；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 （40～70 μm，美國Amersham Pharmacia 公司）；高效薄層GF254、硅膠制備薄層（煙臺江友硅膠開發有限公司）；Powerlab 多功能生理記錄儀、恒溫水浴槽和Labchart Pro 專業版軟件［澳大利亞埃德儀器國際貿易（上海） 有限公司］；FA2004B 電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；DZKW-S-4 電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

1.2 試劑 正丁醇、95%乙醇、二氯甲烷、甲醇、氨水等分析純試劑（成都科隆化工試劑廠）；色譜純甲醇（4 L／瓶，美國Sigma 公司）；顯色劑碘蒸氣、10%硫酸乙醇、改良碘化鉍鉀試劑。

1.3 藥材 川芎飲片由四川新綠色藥業科技發展股份有限公司提供，經成都中醫藥大學國家中藥種質資源庫高繼海副教授鑒定為傘形科多年生草本植物川芎Ligusticum striatumDC.的根莖，標本現存于成都中醫藥大學中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地 （標本號LC-20161030）。

2 提取與分離

取干燥川芎100 kg，加入8 倍量純水煎煮3次，每次2.5 h，藥液合并濃縮，得到水提物（28.8 kg），加熱水分散后用正丁醇萃取，減壓濃縮，得到正丁醇提取物9.3 kg，經D101 大孔吸附樹脂富集，分別用純水、10%、30%、50%、70%、95%乙醇梯度洗脫，回收溶劑得到6 個洗脫部分。50%乙醇洗脫部分（671 g） 經離子交換樹脂富集生物堿，分別用純水、80%乙醇、80%氨水乙醇梯度洗脫，回收溶劑，得到3 個洗脫部分。80%氨水乙醇部分（176 g） 經硅膠色譜柱，用氨水飽和的二氯甲烷-甲醇（100∶1～0∶1）洗脫，獲得12 個餾分（F1～F12）。

F1經反相Sephadex LH-20 柱色譜 （80% 甲醇）、制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇＝20∶1）、半制備HPLC （48% 甲醇），分離得到化合物1（3.5 mg）、2 （8.4 mg）、3 （3.2 mg）。

F4經ODS 反相中壓液相色譜，10%～100%甲醇梯度洗脫，得到12 個洗脫部分（F4-a～F4-l）。F4-f經正相Sephadex LH-20 柱色譜（二氯甲烷-甲醇＝1∶1） 得到5 個部分（F4-f-1～F4-f-5），F4-f-2經反相Sephadex LH-20 柱色譜（30%甲醇），得到7 個部分（F4-f-2a～F4-f-2g），F4-f-2b經制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇-水＝3∶1∶0.1）、半制備HPLC （19% 甲醇），得到化合物4 （1.3 mg）；F4-f-3經反相Sephadex LH-20 柱色譜（30%甲醇）、制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇-水＝2.5∶1∶0.1）、半制備HPLC （10%甲醇），得到化合物5 （1.3 mg）、6（1.2 mg）；F4-f-4經反相Sephadex LH-20 柱色譜（30%甲醇）、制備薄層色譜（二氯甲烷-甲醇-水＝2.5∶1∶0.1）、半制備HPLC （20% 甲醇），得到化合物7 （0.8 mg）、8 （1.1 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇；改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm／z：261.2 ［M ＋H］＋。1HNMR （500 MHz，CD3OD）δ：7.22～7.29 （5H，m，Ar-H），4.25～4.27 （1H，m，H-2′），3.25（1H，dd，J＝4.0，14.0 Hz，H-3a），3.01 （1H，dd，J＝4.0，14.0 Hz，H-3b），2.77～2.80 （1H，m，H-2），1.42～1.72 （3H，m，H-3′，4′），0.83（3H，d，J＝6.5 Hz，H-6′），0.78 （3H，d，J＝6.5 Hz，H-5′）；13C-NMR （125 MHz，CD3OD）δ：167.5 （C-1′），166.1 （C-1），131.1 （C-4），130.4 （C-6，8），128.1 （C-5，9），126.7 （C-7），55.4 （C-2），52.2 （C-2′），43.6 （C-3），38.4 （C-3′），22.9 （C-4′），22.8 （C-6′），21.4（C-5′）。以上數據與文獻［8］報道基本一致，故鑒定為環（L-苯丙氨酸-L-亮氨酸）。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇；改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm／z：247.1 ［M ＋H］＋。1HNMR （600 MHz，DMSO-d6）δ：8.11 （1H，s，HPhe），7.91 （1H，s，H-Val），7.14～7.25 （5H，m，H-5～ H-9），4.21 （1H，m，H-2），3.52（1H，m，H-2′），3.14 （1H，dd，J＝4.2，13.2 Hz，H-3a），2.86 （1H，dd，J＝4.8，13.2 Hz，H-3b），1.69 （1H，m，H-3′），0.64 （3H，d，J＝7.2 Hz，H-4′或H-5′），0.25 （3H，d，J＝7.2 Hz，H-4′或H-5′）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）δ：167.1 （C-1′），166.9 （C-1），136.9 （C-4），130.8 （C-6，8），128.5 （C-5，9），127.0 （C-7），59.7 （C-2），55.6 （C-2′），38.3 （C-3），31.5 （C-3′），18.8 （C-4′），16.7 （C-5′）。以上數據與文獻［9］報道基本一致，故鑒定為環（L-苯丙氨酸-L-纈氨酸）。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；改良碘化鉍鉀顯藍色。ESI-MSm／z：261.2 ［M ＋H］＋。1HNMR （600 MHz，DMSO-d6）δ：8.12 （1H，s，HPhe），7.89 （1H，s，H-Ile），7.17～7.26 （5H，m，H-5～ H-9），4.21 （1H，m，H-2），3.58（1H，m，H-2′），3.16 （1H，dd，J＝4.2，13.2 Hz，H-3a），2.85 （1H，dd，J＝4.8，13.2 Hz，H-3b），1.39 （1H，m，H-3′），0.64 （2H，m，H-4′），0.56 （3H，m，H-5′或H-6′），0.54 （3H，m，H-5′或H-6′）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6）

δ：166.4 （C-1′），166.3 （C-1），136.3 （C-4），130.4 （C-6，8），127.9 （C-5，9），127.0 （C-7），58.7 （C-2），55.0 （C-2′），37.8 （C-3），37.6 （C-3′），23.1 （C-4′），14.4 （C-5′），11.8（C-6′）。以上數據與文獻［9］報道基本一致，故鑒定為環（L-苯丙氨酸-L-異亮氨酸）。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液不顯色，改良碘化鉍鉀不顯色。ESI-MSm／z：135.0 ［M ＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.40 （1H，d，J＝7.8 Hz，H-6），5.62 （1H，d，J＝7.8 Hz，H-5）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：167.3 （C-4），153.5 （C-2），143.5 （C-6），101.7 （C-5）。以上數據與文獻［10］報道基本一致，故鑒定為尿嘧啶。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm／z：149.0 ［M ＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：7.24 （1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），1.87 （3H，d，J＝1.2 Hz，H-7）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：167.5 （C-4），153.8 （C-2），139.2 （C-6），110.4 （C-5），12.1 （C-7）。以上數據與文獻［10］報道基本一致，故鑒定為胸腺嘧啶。

化合物6：淡黃色無定型粉末，易溶于甲醇；碘蒸熏顯黃色，10%硫酸乙醇溶液不顯色，改良碘化鉍鉀不顯色。ESI-MSm／z：148.0 ［M＋Na］＋。1HNMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.02 （1H，d，J＝2.4 Hz，H-2），7.37 （1H，d，J＝9.0 Hz，H-5），7.25 （1H，dd，J＝9.0，3.0 Hz，H-4），4.60（2H，s，H-7）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：155.1 （C-3），152.0 （C-6），137.4 （C-2），125.1 （C-5），123.3 （C-4），65.3 （C-7）。以上數據與文獻［11］報道基本一致，故鑒定為6-羥甲基-3-羥基吡啶。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm／z：146.0 ［M ＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：9.10 （1H，d，J＝1.8 Hz，H-2），8.62 （1H，dd，J＝4.8，1.8 Hz，H-4），8.37（1H，dt，J＝7.8，2.4 Hz，H-5），7.49 （1H，dd，J＝7.8，4.8 Hz，H-6）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：170.86 （C-7），152.02 （C-6 ），151.21 （C-2），138.94 （C-4），132.59 （C-3），124.84 （C-5）。以上數據與文獻［12］報道基本一致，故鑒定為煙酸。

化合物8：白色粉末，易溶于甲醇。ESI-MSm／z：136.1 ［M ＋ H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.20 （1H，s，H-2），8.13 （1H，s，H-8）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：156.8（C-6），153.2 （C-2），151.9 （C-4），141.2 （C-8），118.8 （C-5）。以上數據與文獻［10］報道基本一致，故鑒定為腺嘌呤。

4 對大鼠離體子宮平滑肌收縮活動的影響

采用課題組前期建立的方法［6］，連續2 d 給大鼠灌胃戊酸雌二醇溶液（8 mg／kg／d） 復制動情期大鼠模型。于第3 天頸椎脫臼處死大鼠并迅速剖取子宮，在盛有洛氏液的玻璃皿中取中間段子宮平滑肌2～3 cm，將肌條一端固定于盛有洛氏液20 mL的浴槽中，另一端連接張力換能器，負重為1 g，用十六通道生理記錄系統記錄子宮收縮曲線。以160 μL 縮宮素復制子宮平滑肌收縮模型，DMSO 為空白對照，5×10-7mol／L 鹽酸維拉帕米為陽性對照，給藥組3 個化合物濃度分別為1、10、50 μmol／L，均按照等體積給藥。給藥后，觀察離體子宮平滑肌的收縮張力及收縮活動力（收縮張力平均值×收縮頻率，其中收縮頻率為10 min 內子宮平滑肌的收縮次數），記錄10 min內收縮曲線，計算給藥后收縮活力抑制率和收縮張力抑制率｛ ［（給藥前參數-給藥后參數） ／給藥前參數］×100%｝，重復6 次。采用SPSS 19.0 軟件進行分析，結果以 （x±s） 表示，數據符合正態分布和方差齊性時，多組間均數比較時采用單因素方差分析；數據不符合正態性或方差齊性時，采用秩和檢驗分析，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

結果，鹽酸維拉帕米和3 種生物堿均能不同程度抑制子宮平滑肌收縮。與空白組比較，加入鹽酸維拉帕米后收縮活力抑制率和收縮張力抑制率升高（P＜0.01），化合物1～3 均對子宮收縮活動影響較小，僅高劑量組相對較明顯（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 化合物對子宮平滑肌收縮活動的影響（，n＝6，%）Tab.1 Effects of compounds on contractile activity of uterine smooth muscle （， n＝6，%）

表1 化合物對子宮平滑肌收縮活動的影響（，n＝6，%）Tab.1 Effects of compounds on contractile activity of uterine smooth muscle （， n＝6，%）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

5 討論

生物堿作為川芎主要活性物質之一，目前發現的有川芎嗪、川芎哚、鹽酸三甲胺、鹽酸膽堿、尿嘧啶、腺苷等［13］，類型涵蓋吡嗪類、咔啉類、季胺鹽類、核苷類，其藥理作用主要包括保護缺血性心肌細胞、保護缺血性-再灌注性損傷細胞、抑制子宮平滑肌收縮活動等［1，6，14-19］。本實驗利用現代科學技術手段從川芎中分離得到8 個生物堿，其中1～3 為二酮哌嗪類，在藁本屬中鮮有報道。現代藥理研究表明，二酮哌嗪類生物堿具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫抑制、神經保護、抗瘧疾、抗朊病毒、抗高血糖等多種顯著的生物活性，本實驗在前期發現川芎總生物堿具有顯著抑制子宮平滑肌活性［6］的基礎上，首次發現該類化合物具有緩解子宮平滑肌痙攣作用，可為闡明川芎調經之傳統功效提供科學依據。

圖1 化合物1～3 對子宮平滑肌收縮活動的影響Fig.1 Effects of compounds 1-3 on contractile activity of uterine smooth muscle