HPAEC-PAD 法測定霍山石斛中6 種單糖

劉軍玲高海濤蒲婧哲張亞中

（1.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051； 2.安徽中醫藥大學，安徽合肥 230031； 3.中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，安徽合肥 230051）

霍山石斛Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng 主要含有多糖、生物堿、黃酮類、氨基酸、微量元素等成分，其中糖類作為主要活性物質，對其含有量及組成進行研究具有重要意義［1］。脈沖安培檢測器（PAD） 是一種用于測量電活性分子在工作電極表面氧化或還原反應時所產生電流變化的檢測器，當發生氧化反應時，電子由電活性被測物質向安培池的工作電極方向轉移；當發生還原反應時，電子由工作電極向被測物質方向移動，常用于測定糖類、氨基酸類化合物［2-8］。本研究將該方法與高效陰離子交換色譜（HPEAC） 相結合，引入霍山石斛單糖含有量測定中。

1 材料

ICS-5000 離子色譜儀（戴安Dionex 公司），配置脈沖安培檢測器（Au 電極，糖電位四波形）。D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、果糖對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。霍山石斛20 批，具體見表1。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 取D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-無水葡萄糖D-甘露糖、果糖適量，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，分別制成0.5、0.5、0.5、5、5、5 mg／mL貯備液，各精密量取1 mL 至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得。

2.2 供試品溶液制備 取藥材0.5 g，精密稱定，置于50 mL 具塞三角玻璃瓶中，加入15 mL 去離子水，于65 ℃水浴中超聲處理30 min，冷卻至室溫，離心（8 000 r／min） 20 min。移取上層液體5 mL于50 mL 離心管中，加入無水乙醇20 mL，搖勻后置于4 ℃放置12 h，離心20 min，棄去上清液，殘渣用8 mL 水復溶，離心10 min，取2 mL 上清液于耐壓反應罐中，加入2 mL 4 mol／L TFA 水溶液，將反應罐置于80 ℃中反應2 h，冷卻，反應液在30 ℃下氮氣吹干，10 mL 去離子水溶解殘渣，取2 mL，去離子水定容至10 mL，即得。溶液過0.22 μm 微孔濾膜和RP 柱后，直接進樣分析。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.3 色譜條件 戴安ICS-5000 色譜柱，CarboPac PA20 分析柱（150 mm×3 mm），CarboPac PA20 保護柱（30 mm×3 mm）；安培檢測器溫度30 ℃；電極材料Au；參比電極pH-Ag／AgCl；電位波形糖四電位；體積流量0.45 mL／min；進樣量25 μL；淋洗液梯度洗脫，程序見表2，色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密稱取適量對照品，配制含D-阿拉伯糖0.448 mg／mL、D-半乳糖0.541 mg／mL、D-無水葡萄糖3.582 mg／mL、木糖0.520 mg／mL、甘露糖5.465 mg／mL、果糖0.968 mg／mL的母液，逐級稀釋成不同質量濃度，在“2.3”項條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表3，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

圖1 各成分離子色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of various constituents

2.4.2 精密度試驗 取對照品貯備液，在“2.3”項條件下進樣測定6 次，測得6 種單糖峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，在“2.3”項條件下于0、1、2、4、6、8 h 進樣測定，測得D-阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-果糖峰面積RSD 分別為077%、0.64%、0.80%、0.67%、1.62%、1.83%，表明溶液在8 h 內穩定性良好。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.4.4 重復性試驗 取同一批藥材，按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3”項條件下進樣測定，測得6 種單糖峰面積RSD 均小于2%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取含有量已知的藥材6份，每份0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入各對照品溶液適量，在“2.3”項條件下進樣測定，計算回收率，結果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.4.6 樣品含有量測定 取20 批藥材，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”項條件下測定，計算含有量，結果見表5。

表5 各成分含有量測定結果（mg／g）Tab.5 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 討論

3.1 方法優勢 HPAEC-PAD 避免了用比色法［9］、分光光度法［10］、GC 法［11］、HPLC 法［12］檢測時存在的問題，具有靈敏度高、準確度好、重復性理想的特點。

3.2 條件選擇 本實驗考察NaOH 淋洗液濃度10、5、3 mmol／L，發現當大于5 mmol／L 時6 種單糖色譜峰有重疊，分離度較低，因此選擇3 mmol／L。由于脈沖安培檢測器是在堿性條件、電化學響應下實現的，因此每次進樣前采用高濃度NaOH（200 mmol／L，5 min） 平衡柱子，并進行再生處理，以避免靈敏度降低。

3.3 多糖分析 霍山石斛中單糖主要為D-甘露糖、D-葡萄糖、果糖，而半乳糖、D-阿拉伯糖、D-木糖含有量較低。