花鹿茸切制工藝的優(yōu)化

單國順，趙啟苗，臧彬如，高 慧，張 凡，賈天柱*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連 116600； 2.遼寧中醫(yī)藥大學杏林學院，遼寧沈陽 110167）

鹿茸為鹿科動物梅花鹿Cervus nipponTemminck或馬鹿Cervus elaphusLinnaeus 的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者習稱“花鹿茸”，后者習稱“馬鹿茸”，其味甘、咸，性溫，歸腎、肝經(jīng)，具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒的功效，多用于腎陽不住、精血虧虛、陽痿滑精、宮冷不孕、羸瘦、神疲、眩暈、耳鳴等癥，被列入“東北三寶”之一［1-4］，多以薄片使用，但長期以來有關(guān)其切制工藝的研究卻鮮有報道。因此，為了規(guī)范花鹿茸切制工藝，保證飲片質(zhì)量和臨床療效，本研究以其主要活性成分為指標，采用單因素試驗結(jié)合正交試驗對其切制工藝進行優(yōu)化。

1 材料

UV-T6 紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KQ-250DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AE240 分析天平（十萬分之一，瑞士 Mettler-Toledo 公司）；FA1004B 電子天平 （上海精密科學儀器有限公司）；X／WT 數(shù)顯調(diào)節(jié)儀電熱恒溫水浴鍋（余姚市顯星儀器有限公司）。葡萄糖對照品 （批號wkq16082202，四川省維克奇生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（批號S91139，北京索萊寶科技有限公司）；甘氨酸（批號DST180603-134，成都德思特生物技術(shù)有限公司）；考馬斯亮藍G-250 （批號K18443，優(yōu)級純，北京索萊寶科技有限公司）；茚三酮（批號D1111A，優(yōu)級純，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、鹽酸、丙三醇、異丙醇、醋酸鈉、乙酸、酚酞均為分析純；水為純凈水。

花鹿茸購自遼寧貴金生物醫(yī)藥有限公司，批號20180505001，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為鹿科動物梅花鹿Cervus nipponTemminck 的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。

2 方法與結(jié)果

2.1 總糖含有量測定

2.1.1 對照品溶液制備 取葡萄糖對照品約503.9 mg，精密稱定，少量水溶解并定容于10 mL量瓶中，制成50.39 mg／mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存，用時以水稀釋至0.503 9 mg／mL。

2.1.2 供試品溶液制備 取花鹿茸片（3 號篩）粉末約1.0 g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，加濃鹽酸20 mL、蒸餾水30 mL，沸水煮60 min，濾過，加1 滴酚酞試劑，10%NaOH 溶液中和至微紅色，定容于100 mL 量瓶中，混勻，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL對照品溶液，加水定容至1.0 mL，加入1.5 mL DNS 試劑，充分混勻后沸水浴加熱5 min，流水冷卻后再向各試管中加入4 mL 蒸餾水，混勻，測定500 nm波長處吸光度。以葡萄糖含有量為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A） 進行回歸［5-9］，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.4 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液0.5 mL，按“2.1.3”項下方法測定，測得吸光度RSD 為0.91%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 取同一花鹿茸粉末6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下方法測定，測得總糖含有量RSD 為2.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液1.0 mL，顯色后于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h 按“2.1.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.46%，表明溶液在顯色后4 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 取6 份總糖含有量已知的花鹿茸粉末各0.5 g，加入適量對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下方法測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 總糖加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for total sugar （n＝6）

2.2 水溶性蛋白含有量測定

2.2.1 對照品溶液制備 取牛血清白蛋白（BSA）約200.0 mg，精密稱定，少量蒸餾水溶解并定容于10 mL 量瓶中，制成20.0 mg／mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存，用時以水稀釋至0.2 mg／mL。

2.2.2 供試品溶液制備 取花鹿茸片（3 號篩）粉末約1.0 g，精密稱定，置于50 mL 錐形瓶中，加20 mL 水，超聲（250 W、50 Hz） 處理10 min，重復(fù)3 次，合并提取液，離心后用水定容至100 mL，混勻，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 對照品溶液，加水定容至0.5 mL，搖勻，加入考馬斯亮藍G-250 染色液5 mL進行染色，反應(yīng)5 min 后測定595 nm 波長處吸光度。以BSA 含有量為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A） 進行回歸［9-11］，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液0.5 mL，按“2.2.3”項下方法測定，測得吸光度RSD 為1.53%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗 取同一花鹿茸粉末6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下方法測定，測得水溶性蛋白含有量RSD 為2.18%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液1.0 mL，顯色后于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h 按“2.2.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.38%，表明溶液在顯色后4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 取6 份水溶性蛋白含有量已知的花鹿茸樣品粉末各0.5 g，加入適量對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下方法測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 總水溶性蛋白加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for water-solubility protein（n＝6）

2.3 總游離氨基酸含有量測定

2.3.1 對照品溶液制備 取甘氨酸對照品約125 mg，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，加水溶解，定容至5.05 mg／mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存，用時以水稀釋至0.050 5 mg／mL。

2.3.2 供試品溶液制備 按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 對照品溶液，置于25 mL 比色管中，加水補足1.0 mL，依次加入磷酸鹽緩沖液（pH 8.0） 0.5 mL、2% 茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴加熱10 min 后取出，冷卻至室溫，加水定容至刻度，搖勻，測定570 nm 波長處吸光度。以甘氨酸含有量為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸［12-13］，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密吸取“2.3.2”項下供試品溶液1.0 mL，按“2.3.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為0.20%，表明該方法精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一花鹿茸粉末6 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下方法測定吸光度，測得總游離氨基酸含有量RSD 為4.63%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液1.0 mL，顯色后于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h 按“2.3.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.02%，表明溶液在顯色后4 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 取6 份總游離氨基酸含有量已知的花鹿茸粉末各0.50 g，加入適量對照品溶液，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下方法測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表4。

表4 總游離氨基酸加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for total free amino acid（n＝6）

2.4 單因素試驗

2.4.1 去毛方式 選取3 根未去毛花鹿茸，以茸體外觀性狀為指標，對刮去毛、火燎去毛、火燎后再刮去毛3 種去毛方法進行比較。由表5 可知，火燎后再刮去毛可以更好地去凈茸體表面的毛，而且簡便易行。

表5 去毛方式單因素Tab.5 Single factors of hair remover method

2.4.2 潤制［2］

2.4.2.1 乙醇體積分數(shù)考察 選取4 段相同規(guī)格的去毛花鹿茸，稱定質(zhì)量，從鋸口分別加入40%、50%、60%、70%乙醇進行潤制，潤透后切片，陰干，以潤制時間和干燥時間為指標，確定合適的乙醇濃度。由表6 可知，花鹿茸潤制以60% 乙醇較合適。

表6 乙醇體積分數(shù)單因素Tab.6 Single factors of ethanol concentration

2.4.2.2 加酒量考察 選取4 段相同規(guī)格的去毛花鹿茸，稱定質(zhì)量，以潤制程度為指標，按照它與白酒（60%乙醇） 1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3 的比例，從鋸口加入白酒進行潤制。由表7 可知，加酒量以1∶1 較為合適。

表7 加酒量單因素Tab.7 Single factors of wine addition

2.4.2.3 潤制時間考察 選取4 段相同規(guī)格的去毛花鹿茸段，按照它與白酒1∶1 的比例，以潤制程度為指標，分別考察潤制5、6、7、8 h 時的效果。由表8 可知，潤制時間以6 h 較為合適。

表8 潤制時間單因素Tab.8 Single factors of moistening time

2.4.3 蒸制 選取4 段相同規(guī)格的去毛花鹿茸段，以軟化程度為指標，考察蒸制0、1、5、10 min 的蒸制效果。由表9 可知，蒸制時間以1 min 較為合適。

表9 蒸制時間單因素Tab.9 Single factors of steaming time

2.5 正交試驗 根據(jù)前期文獻調(diào)研及單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)（A）、潤制時間（B）、蒸制時間（C）、干燥方式（D） 作為影響因素，每個因素3 個水平，選用L9（34） 正交表設(shè)計試驗，因素水平見表10。

表10 因素水平Tab.10 Factors and levels

2.6 正交試驗結(jié)果 取規(guī)格一致的去毛花鹿茸段，按照表10 進行試驗，測定總糖、水溶性蛋白、總游離氨基酸含有量，平行2 次。

根據(jù)各成分功效設(shè)計權(quán)重，綜合評分T＝M×30／總糖最高含有量＋N×40／總蛋白最高含有量＋O×30／總氨基酸最高含有量，其中，M為總糖含有量，N為水溶性蛋白含有量，O為總游離氨基酸含有量。結(jié)果見表11，方差分析見表12。

由此可知，各因素影響程度依次為C＞B＞D＞A，即蒸制時間＞潤制時間＞干燥溫方式＞乙醇體積分數(shù)，初步確定最優(yōu)切制工藝為A2B3C1D2，即花鹿茸以50%乙醇潤制7 h 后，常壓蒸制1 min，并采用低溫烘干的方式進行干燥。

表11 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.11 Design and results of tests

表12 方差分析Tab.12 Analysis of variance

由于白酒中乙醇體積分數(shù)具有顯著影響，而潤制時間、蒸制時間、干燥方式具有極顯著影響。因此，最終確定為花鹿茸經(jīng)火燎后再用竹片刮去毛，含50%乙醇的白酒與其比例為1∶1 潤制7 h 后，常壓蒸制1 min，并采用低溫烘干的方式進行干燥。

2.7 驗證試驗 選取3 段相同規(guī)格的花鹿茸段，以優(yōu)化工藝進行切制，并按“2.1”“2.2”“2.3”項下方法制備供試品溶液并測定，結(jié)果見表13。

表13 驗證試驗結(jié)果（n＝3）Tab.13 Results of verification tests （n＝3）

由此可知，3 份樣品中總糖、水溶性蛋白、總游離氨基酸含有量均較高，綜合評分均大于95，表明該工藝切實可行。

3 討論

3.1 指標成分及測定方法選擇 研究表明，花鹿茸中的水溶性蛋白質(zhì)、多肽、糖類及氨基酸成分是其主要活性物質(zhì)［14-17］。因此，本研究選取總糖、水溶性蛋白、總游離氨基酸作為指標，用于花鹿茸切制工藝的優(yōu)化研究。

花鹿茸中含有黏多糖、硫酸軟骨素、酸性多糖等多種活性多糖，為了對該類物質(zhì)進行測定，本研究選擇了3，5-二硝基水楊酸比色法，并在相關(guān)研究［5-9］的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)該方法準確可行。花鹿茸中蛋白質(zhì)種類繁多豐富，并且具有重要的生物活性，是其水溶性成分中的重要部分，本研究選擇了經(jīng)典的考馬斯亮藍染色法用于其含有量測定［9-11］。花鹿茸中氨基酸含有量豐富，包含多種人體必需者，本研究參考GB／T 8314-2013 茶中游離氨基酸總量測定的方法，建立了該成分檢測手段［12-13］，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定可行。

3.2 工藝優(yōu)化 本研究通過單因素試驗初步確定了花鹿茸切制較為適宜的因素水平范圍后，進一步在正交試驗中選擇了總糖、水溶性蛋白、總游離氨基酸作為指標，白酒中乙醇體積分數(shù)、潤制時間、蒸制時間、干燥方式作為影響因素進行優(yōu)化。結(jié)果，最優(yōu)切制工藝為花鹿茸去毛后經(jīng)鋸口按1∶1的比例加入白酒 （50% 乙醇） 潤制7 h，蒸制1 min，趁熱橫切為厚度1～2 mm 的薄片，平鋪于烘盤上，上覆吸水紙并壓以重物，50 ℃下烘干，該工藝切實可行，既可保證飲片質(zhì)量和療效，又能為其工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

鑒于花鹿茸不同部位中有效成分含有量的差異較大，本研究僅選擇血片至紅粉片進行考察。今后，將對花鹿茸其他部位的切制工藝開展進一步研究。