不同產地及變型天麻有效成分差異性分析

田孟華袁天軍周 瑞楊新周

（1.昭通市天麻研究院，云南昭通 657000； 2.德宏師范高等專科學校民族醫藥研究所，云南德宏 678400； 3.德宏師范高等專科學校理工學院，云南德宏 678400； 4.云南華衡檢測技術有限公司，云南昆明 650106）

天麻為蘭科真菌營養型多年生草本植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥塊莖，是我國傳統名貴中藥材之一，始載于《神農本草經》，位列上品［1］，在中國等東亞國家已有上千年的應用歷史［2］。現代藥理研究表明，天麻對預防和治療中樞神經系統、心血管、免疫系統疾病具有一定功效［3-5］，臨床常用于治療頭暈目眩、肢體麻木、癲癇抽搐、小兒驚風、風濕痹痛等癥［6-8］富含多種營養成分和礦質元素［9］，已廣泛用于食品輔料，如“天麻蒸蛋”“天麻烏骨雞”“天麻粥”等［10］。它作為藥食同源滋補保健類藥材，含酚酸、甾醇、有機酸、脂類、多糖等多種成分，其中酚酸中的天麻素（Gas）、天麻腺苷、對羥基苯甲醇（HA）、對羥基苯甲醛（HBA）、巴利森A （PA）、巴利森苷B （PB）、巴利森苷C （PC）、巴利森苷E （PE） 是主要活性物質［11-13］，具有鎮痛、降壓、抗驚厥、保護神經細胞等作用［14-15］，也是目前該藥材及其中成藥質量評價的重要指標成分［16］，但2015 年版《中國藥典》 僅規定天麻素、對羥基苯甲醇總量不得低于0.25%［2］。中藥材成分復雜，其多組分、多靶點協同作用于機體，符合中醫整體論和系統論［17］，僅檢測單一或少數成分難以有效評價藥材質量。不同產地種植的天麻隨栽培土壤、氣候環境變化，其功效和有效成分含有量均有較大差異，王信等［18］建立了6 種天麻素類成分的一測多評法用于質量控制；王慶等［19-20］研究了西南地區 （云南、貴州、四川） 3 種變型天麻（紅天麻、烏天麻、綠天麻）中多酚、多糖、氨基酸、天麻素、巴利森苷成分的含有量，發現不同產地、變種所含成分存在較大差異。本實驗廣泛采集全國主產地天麻，對其中8 種有效成分及總天麻素含有量進行分析，利用差異性、相關性、主成分、因子載荷分析對不同產地及變型品種有效成分的差異特征及影響因素進行探析，篩選相關標志物，以期為藥材質量評價及其產地、變型鑒別提供科學依據。

1 材料

LC-20A 型RP-HPLC 色譜儀 （配置LC-20AT高壓雙泵、SPD-20A 檢測器、SIL-20A 自動進樣器，島津企業管理有限公司）；CP124C 電子分析天平 （萬分之一，奧豪斯儀器有限公司）；CP1502C 電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；RE-3000A 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；乙醇、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純；水為超純水。腺苷對照品購于中國食品藥品檢定研究院；天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷、巴利森苷B、巴利森苷對照品C 均購于上海源葉生物科技有限公司。

天麻采自云南、四川、湖北、貴州、陜西、安徽、甘肅、吉林等省，其中省外13 個、省內8 個，經昭通市天麻研究院田孟華工程師鑒定為正品，具體見表1。樣品切片自然晾干后粉碎，過0.3 mm篩，裝入自封袋中貯存備用。

2 方法

2.1 色譜條件 Inert Sustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫 （0～8 min，1%～2% B；8～15 min，2%～8% B；15～25 min，8% B；25～35 min，8%～15% B；35～45 min，15% B；45～50 min，15%～20%B；50～60 min，20%B）；體積流量1.0 mL／min；檢測波長270 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備及線性關系考察 乙腈-水（10∶ 90） 混合溶液將各對照品制成含腺苷0.020 4 mg／mL、天麻素0.100 8 mg／mL、對羥基苯甲醇0.062 8 mg／mL、對羥基苯甲醛0.010 0 mg／mL、巴利森苷A 0.200 4 mg／mL、巴利森苷B 0.201 6 mg／mL、巴利森苷C 0.200 8 mg／mL、巴利森苷E 0.202 4 mg／mL的溶液，即得。以溶液質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。色譜圖見圖1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 供試品溶液制備 精密稱取樣品2 g，置于具塞三角瓶中，精密加入70% 乙醇50 mL，稱定質量，90 ℃水浴回流3 h，冷卻至室溫，70%乙醇補足減失的質量，濾過，吸取10 mL 濾液2 份，蒸干。其中，1 份用10%乙腈溶解，轉移至10 mL 量瓶中，10%乙腈定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

另1 份用2%氫氧化鈉-10%乙腈混合溶液5 mL溶解，轉移至10 mL 量瓶中，搖勻，室溫放置2 h充分水解，5% 鹽酸調pH 至4～5，10% 乙腈稀釋5～10倍，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取濾液，作為總天麻素待測液。

3 結果

3.1 成分分析 表3 顯示，HBA、腺苷含有量以云南普洱21＃樣品最高，變異最小；Gas、PB 含有量以云南麗江19＃樣品最高，差異較大；云南昭通14＃、四川樂山1＃樣品、安徽安慶8＃、貴州同仁4＃樣品分別以PB、HA、PC、PA 含有量最高。由此可知，不同產地間有效成分含有量存在一定差異。

3.2 相關性分析 表4 顯示，天麻中不同有效成分含有量之間存在一定的相關性，其中腺苷與HA呈負顯著相關，與PE 呈顯著相關；PB、PC、PA、總天麻素與Gas 之間呈顯著或極顯著相關，HBA與P 呈顯著負相關。由此推測，可能存在相互轉化或累積代謝途徑的相互影響。

表3 不同產地樣品成分分析（mg／g）Tab.3 Composition analysis of samples from different growing areas （mg／g）

表4 天麻素及其他有效成分之間的相關性Tab.4 Correlations between gastrodin and the other effective components

3.3 天麻有效成分對不同產地的影響 采用SPSS 19.0 軟件結合SIMCA P ＋10.5 軟件對不同產地天麻有效成分含有量進行主成分分析，提取主成分數，并探析它對產地分類的影響。結果見表5、圖2～3。

表5 中，對不同產地21 批樣品中8 種有效成分及總天麻素采用最大方差化旋轉后降維分析，根據初始特征值≥1 的原則，發現不同成分對產地均具有一定影響，所提取的4 種主成分累積影響因子達85.161%，Gas、PB、PC、PA、總天麻素對第1主成分具有較大貢獻，腺苷、HBA 對第2 主成分具有較大貢獻，HA 對第3 成分具有較大貢獻，PE對第4 主成分具有較大影響。其中，第1、2 主成分總累積貢獻率為53.911%，接近60%，表明兩者所提取的因子貢獻率對產地分析具有較大影響。

表5 旋轉后不同產地樣品有效成分提取結果Tab.5 Extraction results of effective components in samples from different growing areas after rotation

圖2 21 批樣品主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis plot for twenty-one batches of samples

由圖2 可知，8 種有效成分及總天麻素含有量可將不同產地樣品進行有效分類。其中，在主成分1、2 空間中云南、吉林產地樣品能有效分類，而四川、貴州、湖北產地樣品與云南產地較為接近，這可能與產地間的生態環境相近有關。圖3 表明，第1 主成分提取的HA、HBA、PE 對四川、云南產地樣品分類的影響較大，而PB、總天麻素、Gas、PA、PC 腺苷對湖北、陜西、貴州等產地樣品的分類具有較大影響，尤其是對湖北、陜西；第2 主成分提取的HA、HBA、PE、PB、Gas 對四川、云南、湖北產地樣品的分類具有正貢獻，而腺苷、PA、PC 對陜西、貴州、甘肅、安徽產地樣品的分類具有較大影響。由此顯示，不同產地天麻有效成分對其分類具有不同程度的影響。

圖3 各成分載荷圖Fig.3 Loading diagram of various constituents

3.4 天麻有效成分對不同變型天麻的影響 進一步分析天麻內在有效成分含有量對不同變型天麻的影響，結果見表6、圖4～5。

由表6 可知，提取的3 個主成分因子對變型分類的貢獻率達81.9%，表明三者能有效識別不同變型的樣品。

表6 不同變型主要有效成分提取結果（%）Tab.6 Extraction results of main active ingredients in different varieties （%）

圖4 不同變型主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis plot of different variations

由圖4 可知，8 種有效成分和總天麻素含有量可將不同變型天麻樣品進行有效分類。其中，在主成分1、2 空間中烏綠天麻、烏天麻、綠天麻間存在較大差異，而黃天麻、紅天麻、烏紅天麻之間差異不明顯。對不同變型樣品進行載荷分析時發現，Gas、HA、PE、PB、總天麻素對烏天麻分類具有較大的正貢獻，而PA 具有較大的負貢獻，其中PE、PA 可作為它與其他天麻變型之間差異性分析的標志性物質；腺苷、HA 對綠天麻分類分別具有較大負、正貢獻，可作為其分類的模式物質；烏紅天麻、黃天麻、紅天麻之間相似度較高，主要區別在于HA、PE、PC、總天麻素、PA；烏綠天麻與其他天麻均具有較大差異，主要表現為除了HBA對其分類有正貢獻外，其余指標均呈負貢獻。

圖5 有效成分對變型分類貢獻的影響Fig.5 Effects of active ingredients on classification contribution of varieties

4 討論與結論

不同產地種植的天麻隨栽培土壤、氣候環境變化，其有效成分含有量均具有較大差異。本實驗結果顯示，不同產地樣品8 種有效成分及總天麻素含有量具有一定差異，提取的特征成分可在主成分空間內有效識別產地差異，也可用于不同變型的差異性識別，尤其是PE、PA，可作為烏天麻與其他天麻變型之間差異性分析的標志物；腺苷、HA 對綠天麻分類分別具有較大負、正貢獻，可作為其分類的模式物質。綜上所述，該方法可為后續天麻及其不同變型品質的評價及鑒定提供新思路。