黃芩素與黃芩苷微生物和肝臟代謝異同研究

解立科 田小亭郭小珍劉 歡王洋洋陳明蒼*包海鷹*

（1.吉林農業大學中藥材學院，吉林長春 130300； 2.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203）

黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，可清熱燥濕、涼血解毒、瀉火安胎等［1］，其主要黃酮類成分黃芩素和黃芩苷具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝等活性［2-7］。

黃芩苷是由黃芩素與一分子葡萄糖醛酸結合形成的糖苷類化合物，大鼠分別靜脈注射等量的黃芩苷和黃芩素后在血中均能同時檢測到兩者，表明它們可以在體內相互轉化［8］，但體內藥效并不一致。在飲水電擊沖突實驗中，黃芩素、黃芩苷抗焦慮的藥效劑量分別為10、20 mg／kg［9］，這可能與黃芩素有比黃芩苷更高的生物利用度有關，為后者的236%［10］。目前，盡管已有多篇文獻對動物口服黃芩苷或黃芩素的體內代謝物進行了系統研究［11-12］，但并不能明確其具體的生成位點，需要借助體外代謝工具進行驗證。針對黃芩苷和黃芩素的體外代謝，僅有文獻鑒定前者在人體外腸道菌中的代謝物［13］，尚未比較兩者在大鼠肝臟和腸道菌的體外代謝。

近年來，LC-MS 由于其靈敏高、速度快、準確度好等優勢，在藥物代謝物鑒定方面廣泛應用［14］。質譜分析數據的可靠性和可信度取決于所用的儀器，其中LC-Q-TOF 因其高分辨數據和快速掃描速度，成為高效率的代謝物鑒定工具；相比于低分辨數據，Q-TOF 質量分析器可提供精確的分子量，生成分子離子和碎片離子的元素組成式，區分具有相似分子量的化合物［15］。

本研究擬采用大鼠腸道菌和肝勻漿體外孵育模型，利用高分辨質譜HPLC-Q-TOF 鑒定黃芩苷、黃芩素微生物和肝臟代謝產物的異同，以期為闡釋兩者體內外代謝規律提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 系列高效液相色譜儀與具有雙噴Jet stream 離子源的Agilent 6530 Q-TOF 相連（美國Agilent 公司）；高速離心機（德國Eppendorf公司）；精密天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；超純水器（美國Millipore 公司）；真空濃縮儀（美國Thermo Fisher 公司）；Vortex-Genie 振蕩器（美國Scientific 公司）；超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 黃芩苷（純度≥98%，批號MUST-14083014）、黃芩素 （純度≥98%，批號MUST-17031608） 對照品均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司。乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；其他試劑均為國產分析純。還原輔酶Ⅱ四鈉鹽（NADPH）（純度＞95%，瑞士羅氏公司）；磷酸緩沖液（美國GE 公司）；DMSO （美國Sigma 公司）；厭氧培養液（批號20180616，青島高科園海博生物技術有限公司）。

1.3 動物 SD 大鼠［生產許可證號SCXK （滬）2017-0005，體質量（200±20） g］購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于中國科學院上海藥物研究所屏障環境實驗動物室 ［溫度 （24±2） ℃，相對濕度（70±5）%］。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 精密稱取適量黃芩素、黃芩苷對照品，DMSO 溶解后加入磷酸緩沖液制成400 μmol／L，即得（DMSO＜1／1 000）。

2.1.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH） 溶液 精密稱取適量NADPH，加磷酸鹽緩沖液制成1 mg／150 μL，即得，現配現用。

2.1.3 厭氧培養液 稱取厭氧培養液9.5 g，加熱攪拌溶于1 000 mL 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，即得。

2.2 大鼠肝勻漿和腸道菌制備 空白大鼠過夜禁食，自由飲水，無菌條件下腹主動脈取血處死，迅速剪開腹腔取出肝臟，立即放于冰塊上，用預冷生理鹽水沖洗至灰色，稱定質量，去除粘連組織后剪碎，加入5 倍量磷酸緩沖溶液，放入勻漿機中制備勻漿。

另取空白組大鼠過夜禁食，自由飲水，無菌條件下腹主動脈取血處死，取腸道內容物，腸壁用少量（生理鹽水） 沖洗，與腸道內容物合并，按1 g／5 mL劑量加入無菌生理鹽水，快速攪拌均勻，醫用紗布過濾得腸道菌溶液。所有操作均在厭氧條件下進行。

2.3 大鼠肝勻漿和腸道菌孵化反應體系 肝勻漿孵化體系的總反應體積為200 μL。分為空白組（不含黃芩苷、黃芩素） 和400 μmol／L 黃芩苷、黃芩素組。先將50 μL 肝勻漿液加入EP 管中，再依次加入黃芩苷、黃芩素供試品溶液，NADPH 溶液，緩沖液各50 μL，反復吹打混勻以防止產生氣泡，在37 ℃恒溫搖床中孵育，于10、30、60、120 min時加入200 μL 預冷乙腈終止反應，4 ℃下14 000 r／min 離心10 min，取上清液待分析。所有樣品平行制備3 份。

取厭氧培養液18 mL，加入腸道菌及黃芩素、黃芩苷供試品溶液各1 mL，使其終濃度為16 μmol／L，置于厭氧培養罐中，迅速放入厭氧產氣袋中，封閉體系，在37 ℃下厭氧培養，于0、1、2、4、8、12、24 h 加3 倍量冰乙腈終止反應，14 000 r／min離心10 min，取上清液待分析。所有樣品平行制備3 份。

2.4 分析條件

2.4.1 色譜條件 ACE Excel 3 super C18色譜柱（100 nm×2.1 nm，3.0 μm）；流動相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，80% A；2～3 min，70%A；3～10 min，70%A；10～12 min，10%A；12～15 min，10% A；15～16 min，80% A；16～20 min，80%A）；體積流量0.35 mL／min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL。

2.4.2 質譜條件 ESI 離子源，正離子檢測模式；毛細管電壓4 kV；噴霧電壓5 000 V；出口電壓110 V；霧化氣壓力35 Pa；氮氣體積流量5 L／min，溫度300 ℃；鞘氣體積流量11 L／min，溫度350 ℃。采用高分辨全掃描，一級掃描分辨率30 000，二級掃描分辨率15 000，質量掃描范圍m／z100～1 200。

2.5 數據分析 利用Qualitative Analysis B.06.00和MetaboliteID B.04.00 工作站進行處理。

3 結果

3.1 檢測條件優化及其裂解規律推斷 本研究考察了不同比例甲酸作為流動相改性劑對色譜-質譜分析的影響，發現0.1%甲酸可獲得良好的色譜峰形和質譜響應信號。黃芩苷、黃芩素在正離子下產生的碎片離子種類和強度相關優于負離子，因此檢測均采用正離子模式。另外，鑒于原形和代謝物具有共同骨架，后者推測要依賴于前者裂解途徑。

原形成分M0-1黃芩素準分子離子峰為［M ＋H］＋m／z271.060 3，保留時間12.174 min，分子式C15H10O5。其裂解途徑遵循黃酮類化合物的經典RDA 裂解。從C 環1，3 位裂解，生成一對互補離子，即含有A 環的離子m／z169.012 8 和含有B 環的離子m／z103.053 9。碎片離子m／z169.012 8 相繼脫去 H2O、CO 分子，形成碎片離子m／z151.002 2、123.007 2。準分子離子還可以先脫去一分子水形成碎片離子m／z253.049 8，并相繼脫去 CO、CO 生成碎片離子m／z225.054 4、197.053 9。其裂解規律見圖1A。

原形成分M0-2黃芩苷準分子離子峰為［M ＋H］＋m／z447.091 9，保留時間為6.920 min，分子式C21H18O11。黃芩苷為黃芩素的葡萄糖醛酸化，因此在二級質譜圖上首先脫去一分子葡萄糖醛酸（176 Da），形成基峰m／z271.059 5。碎片離子m／z271.059 5 的裂解途徑同黃芩素一致，其裂解規律見圖1B。

圖1 各成分質譜裂解規律Fig.1 Framentation rules of various constituents

3.2 黃芩素、黃芩苷代謝產物在肝勻漿孵育體系中的分析鑒定 以黃芩苷和黃芩素的裂解規律為基礎，根據精準分子質量數據結合質譜裂解碎片信息，在黃芩素、黃芩苷肝勻漿孵育樣品中分別鑒定出12、15 個代謝物，離子流圖見圖2，各代謝產物質譜數據見表1，兩者在肝勻漿中的代謝途徑見圖3。

M1準分子離子峰為［M＋H］＋m／z287.055 6，保留時間6.329 min，分子式C15H10O6。從分子式上看M1與黃芩素相差一個氧原子。二級質譜上準分子離子峰脫去一分子H2O，生成碎片離子m／z269.040 0，碎片離子m／z269.040 0 繼續脫去CO、CO 生成碎片離子m／z241.045 8、213.049 7。另外M1可發生RDA 裂解生成帶有A 環的碎片離子m／z169.014 2 和帶有B 環的碎片離子m／z119.050 4。因此，確定羥基化發生在B 環上，M1為黃芩素的羥基化產物。

M2、M8準分子離子峰分別為［M ＋H］＋m／z433.112 6、433.114 1，保留時間分別為6.924、8.543 min，分子式C21H20O10。二級圖譜上，M2準分子離子峰脫去一分子葡萄糖（162 Da） 形成基峰m／z271.058 1?；逡来蚊撊2O、CO、CO形成碎片離子m／z253.046 8、225.052 5、197.059 4，也可發生RDA 裂解碎片離子m／z169.011 4、103.050 2。因此，確定M2、M8分別為黃芩素的糖基化反應產物。

M0-2、M9準分子離子峰分別為［M＋H］＋m／z447.092 6、447.093 0，分子式C21H18O11，保留時間分別為6.920、8.636 min，與對照品比對，鑒定M0-2為黃芩苷。M9二級質譜圖給出基峰m／z271.060 7，為準分子離子峰脫去葡萄糖醛酸（176 Da） 形成，基峰接連脫去H2O、CO、CO 生成碎片離子m／z253.049 5、225.054 2、197.059 4。因此，確定M9為黃芩素的葡萄糖醛酸化產物。

M3準分子離子峰為［M＋H］＋m／z255.066 9，分子式C15H10O4，保留時間7.324 min。準分子離子峰接連脫去CO、CO 生成碎片離子m／z227.075 3、119.074 2，發生RDA 裂解生成碎片離子m／z153.073 6、103.054 3，表明M3的分子式及其碎片離子均比黃芩苷少了一個氧原子。因此，確定M3為黃芩素脫羥基化產物。

M4一級質譜圖中給出的準分子離子峰［M＋H］＋m／z447.130 7，分子式C22H22O10，保留時間7.935 min。二級質譜圖給出的基峰m／z285.067 9，與準分子離子峰相差一分子葡萄糖（162 Da），碎片離子m／z285.067 9 繼續脫去甲基基團形成m／z270.043 1。因此，確定M4為黃芩素的甲基化糖基化反應產物。

M5、M10一級質譜圖中給出的準分子離子峰分別為［M＋H］＋m／z403.103 8、403.104 0，保留時間分別為8.131、9.040 min，分子式C20H18O9。M5、M10的準分子離子峰脫掉分子量為132 Da 的基團后形成的碎片離子m／z271.058 4、271.059 0，即黃芩素的準分子離子峰。因此，確定M5、M10為黃芩素的糖基化（阿拉伯糖或木糖） 反應產物。

M6準分子離子峰為［M＋H］＋m／z461.108 1，保留時間8.139 min，分子式C22H20O11。二級圖譜給出的碎片m／z285.075 1，為準分子離子峰脫去葡萄糖醛酸 （176 Da） 形成，碎片離子m／z285.075 1 繼續脫去甲基基團形成碎片離子m／z270.053 1。因此，確定M6為黃芩苷的甲基化葡萄糖醛酸化。

圖2 各成分提取離子流圖Fig.2 Extracted ion current chromatograms of various constituents

M7準分子離子峰［M＋H］＋m／z431.097 7，分子式C21H18O10，保留時間8.204 min。二級圖譜上基峰m／z255.064 9 為準分子離子峰脫去葡萄糖醛酸（176 Da） 形成。基峰發生RDA 裂解可生成碎片離子m／z153.016 9、103.051 9，推測M7在A環上發生了還原反應，丟失了羥基。因此，確定M7為黃芩苷的脫羥基反應產物。

M11、M16準分子離子峰分別為［M＋H］＋m／z301.072 2、301.070 3，分子式C15H8O4，保留時間分別為11.766、13.592 min。M11準分子離子峰脫去甲基基團形成基峰m／z286.048 1，基峰脫去CO生成m／z258.053 2?；灏l生RDA 裂解生成碎片m／z169.009 4、119.085 4。因此，確定M11為黃芩素羥基化甲基化代謝產物，M16為其同分異構體。

M12準分子離子峰為［M＋H］＋m／z253.048 8，分子式C15H8O40，保留時間12.523 min。從分子式上看，M12與黃芩素相差一個H2O 分子。M12二級質譜給出的碎片離子m／z225.058 1、197.062 9為準分子離子峰接連脫去CO 生成。M12也可發生RDA 裂解，生成碎片離子m／z169.014 2、103.055 4。因此，確定M12為5-羥基，6，7-環氧-2 苯基色原酮或7-羥基，5，6-環氧-2 苯基色原酮。

M0-1、M13準分子離子峰分別為［M＋H］＋m／z271.059 9、271.059 6，分子式C15H10O5，保留時間分別為12.574、13.491 min。與對照品比對，M0-1為黃芩素。M13準分子離子峰相繼丟失H2O、CO、CO，分別生成碎片m／z253.044 3、225.058 6、197.062 9，發生RDA 裂解生成碎片離子m／z169.062 9、103.055 6。鑒于M13的裂解途徑與黃芩素保持一致，但具有不同的保留時間，因此確定M13為黃芩素同分異構體。

M15準分子離子峰為［M＋H］＋m／z285.076 7，分子式C16H12O5，保留時間14.240 min。分子式與黃芩素相比相差一個甲基基團。M15準分子離子峰丟失一個甲基基團后形成基峰離子m／z271.049 6，基峰的裂解途徑與黃芩素一致，即形成碎片離子m／z242.058 0、224.046 7、196.053 1、168.005 1 的碎片離子。因此，確定M15為黃芩素的甲基結合物。

3.3 黃芩素、黃芩苷代謝產物在腸道菌孵育體系中的分析鑒定 以黃芩苷、黃芩素的裂解規律為基礎，根據精準分子質量數據結合質譜裂解碎片信息，在黃芩素、黃芩苷腸道菌孵育樣品中分別鑒定出3、4個代謝物，離子流圖見圖4，各代謝產物質譜信息見表2，兩者在腸道菌中的代謝途徑見圖5。

M16準分子離子峰為［M＋H］＋m／z287.053 7，保留時間7.739 min，分子式C15H10O6。M16與黃芩素在分子式上相差一個氧原子，推測為發生羥基化反應。M16準分子離子峰發生RDA 裂解生成帶有A環的基峰m／z185.006 3 和帶有B 環的碎片離子m／z103.054 3，基峰繼續脫去H2O、CO 形成m／z166.996 8、139.001 4。因此，確定M16羥基化發生在A 環上，為黃芩素的羥基化產物5，6，7，8-四羥基黃酮。

表1 黃芩素、黃芩苷肝勻漿代謝產物質譜信息Tab.1 MS information of baicalein and baicalin metabolites in rat liver homogenate

M17準分子離子峰為［M＋H］＋m／z301.069 6，保留時間11.97 7 min，分子式C16H12O6。M17準分子離子峰脫去甲基基團生成碎片離子m／z286.045 5，也可發生RDA 裂解生成帶有A 環的基峰m／z183.998 9和帶有B 環的碎片離子m／z119.085 4。因此，確定M17的甲基化發生在A 環上，羥基化發生在B 環上，為黃芩素的甲基化、羥基化結合物。

M18準分子離子峰為［M＋H］＋m／z255.064 9，分子式C15H10O4，保留時間14.504 min。準分子離子峰接連發生RDA 裂解，生成帶有A 環的基峰m／z153.017 4 和碎片離子m／z103.054 0，基峰可脫去一分子水形成碎片離子m／z135.044 8。因此，確定M18為黃芩素脫羥基化產物。

4 討論

本實驗建立HPLC-Q-TOF／MS 法研究黃芩苷、黃芩素在體外肝勻漿和腸道菌中的代謝情況，發現18 個代謝產物，包括在體外報道過的3 個［13］、體內報道過的11 個［11-12］，其中M4、M5、M10、M16為首次發現。

圖3 各成分肝勻漿中代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of various constituents in liver homogenates

圖4 各成分經腸道菌代謝產物提取離子流圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of various constituents in intestinal bacteria

在黃芩素、黃芩苷肝勻漿孵育液中分別檢測到12、15 個代謝物。黃芩素主要經歷的Ⅰ相反應有脫水反應、羥基化、脫羥基化反應，Ⅱ相反應有糖基化、葡萄糖醛酸化、甲基化等反應；黃芩苷主要經歷的Ⅰ相反應有羥基化和脫羥基反應，Ⅱ相反應類型有糖基化、甲基化、葡萄糖醛酸化等。肝臟所含豐富的Ⅰ相、Ⅱ相代謝酶是黃芩苷、黃芩素發生廣泛代謝途徑的主要原因［16］，其中共有的有12 個（M0-1、M0-2、M1、M2、M3、M4、M5、M8、M11、M13、M14、M15），而M6、M7、M9、M10只存在于黃芩苷肝勻漿孵育液中，M12只存在黃芩素肝勻漿孵育液中。黃芩苷、黃芩素在各自肝勻漿孵育體系中均能檢測到，表明兩者在肝臟中可相互轉化，也可能是有上述共同代謝物的原因之一。

表2 黃芩素、黃芩苷腸道菌代謝產物質譜信息Tab.2 MS information of baicalein and baicalin metabolites in intestinal bacteria

圖5 各成分經大鼠腸道菌代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways of various constituents in intestinal bacteria

在黃芩苷的腸道菌孵育液中檢測到其脫糖代謝物黃芩素，在腸道菌的作用下可繼續發生甲基化、羥基化、脫羥基化代謝反應。但在黃芩素的大鼠腸道菌孵育液中并沒有檢測到黃芩苷，表明在大鼠腸道菌作用下它僅能單向生成黃芩素，而后者卻不能代謝生成前者。

綜上所述，本研究通過HPLC-Q-TOF 法鑒定黃芩苷、黃芩素在肝勻漿、腸道菌孵育液中的代謝物，明確了兩者代謝物的生成位點，可為闡釋其體內代謝行為提供依據。