美洲大蠊提取物對2，4，6-三硝基苯磺酸誘導大鼠潰瘍性結腸炎的影響

陶 磊，陳金虎，張漢超，劉 彬，陳 瑩，萬 蘋，何 苗*，楊志斌*

（1.大理大學，云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000； 2.藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，四川成都 610000； 3.大理白族自治州人民醫院病理科，云南大理 671000； 4.云南省第一人民醫院消化內科，云南大理 671000）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC） 屬于炎癥性腸病范疇，是一種以腸黏膜炎癥、潰瘍糜爛為病理特征的急、慢性結直腸病癥，其UC 臨床病癥難以治療，易復發，具有癌變傾向，被列為難治愈疾病之一［1］。現代醫學認為UC是在遺傳、環境等多種因素共同影響下，神經內分泌失調和免疫失衡，導致腸黏膜屏障損傷引起局部黏膜潰瘍［2］。目前西醫臨床治療藥物主要為氨基酸水楊酸類、免疫抑制劑類、糖皮質激素類、生物制劑類，但多數藥物不良反應多，療效不穩定且伴有多種并發癥，生物制劑類還因價格昂貴、來源途徑窄、易耐受，使其在臨床使用上受到一定限制［3］；而中醫常辨證施治，以單方或復方湯劑、中成藥治療UC，且較西醫有不良反應少、可緩解臨床癥狀和降低復發率的優勢［4］。現代藥理學研究發現，中藥主要通過多成分協同調節免疫和抗炎途徑達到緩解及治療UC［5］。

美洲大蠊Periplaneta americanaL.是蜚蠊科大蠊屬昆蟲，最早記載于《神農本草經》。其主要含有信息素、生物堿及神經肽類等化學成分，具有組織修復、抗癌、消炎消腫、抗菌等作用［6］。基于課題組前期發現［7］美洲大蠊提取物能緩解UC 疾病活動情況，降低死亡率，故本次擬通過三硝基苯磺酸／乙醇法構建大鼠UC 模型，研究美洲大蠊提取物對UC 大鼠的影響并初步探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，180～220 g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，使用許可證號SYXK （滇） -2011-0004。

1.2 試劑與藥物 美洲大蠊購自好醫生藥業集團，經大理大學昆蟲生物醫藥研究院動物學教授楊自忠鑒定為蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬美洲大蠊Periplaneta americanaL.。取美洲大蠊干品，70% 乙醇加熱回流提取3 次，過濾，合并濾液，濃縮至密度1.25 g／mL，加水脫脂，過濾，濾液濃縮至浸膏，即得美洲大蠊提取物（批號20150317，藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心張成桂副教授提供）。柳氮磺胺吡啶腸溶片（批號20160505） 購自上海信誼天平藥業有限公司；腸炎寧（批號Z36020518） 購自江西天施康弋陽制藥有限公司；MPO 試劑盒（批號20161209）、隱血試劑盒（批號20160824） 購自南京建成生物工程研究所；IL-17 試劑盒（批號R161025-170b）、IL-4 試劑盒（批號R160927-002b） 購自欣博盛生物科技有限公司；IFN-γ 試劑盒（批號E3000-1609-1）、EGF 試劑盒 （批號R161214-104a）、TGF-β1 試劑盒（批號R161101-107a）、TNF-α 試劑盒（批號E3720-1680-2） 購自達科為生物科技有限公司。

1.3 儀器 HC-3018R 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；先行者CP214 型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；醫學圖像分析系統BI-2000 （成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 造模 74 只SPF 級SD 大鼠，正常飼養7 d，根據張漢超等［8］報道的方法對大鼠進行造模，10% 水合氯醛（3 mL／kg） 麻醉大鼠后將其倒立，直徑2 mm 聚乙烯管輕輕插入大鼠肛門深度約8 cm，將0.6 mL 5%三硝基苯磺酸的30%乙醇溶液由注射器經導管緩慢灌注，拔出聚乙烯管并將大鼠進行10 s 倒立。正常對照組同等操作灌腸給予等體積氯化鈉注射液。

2.2 分組及給藥 三硝基苯磺酸／乙醇法致大鼠UC 模型建立后第7 天，參考Hamamoto 等標準［9］進行疾病活動指數（disease activity index，DAI） 評分，根據DAI 評分（0～3 分，極輕度炎癥；4～6 分，輕度炎癥；7～9 分，中度炎癥；10～12 分，重度炎癥） 進行分組，選擇可納入實驗的輕中度炎癥造模大鼠60 只。根據DAI 評分分層后隨機分為模型組，腸炎寧組（600 mg／kg），柳氮磺胺吡啶組（300 mg／kg），美洲大蠊提取物低 （50 mg／kg）、中（100 mg／kg）、高（200 mg／kg） 劑量組，于模型建立第8天進行相應給藥治療，灌胃給藥，其中正常對照組和模型組給予氯化鈉注射液，1 次／d，連續14 d。給藥第1、4、7、14 天進行DAI 評分。

2.3 血清IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-17 水平測定 末次給藥后禁食不禁水24 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血于4 ℃靜置凝固，以3 000 r／min 離心10 min 取血清，采用ELISA 法檢測IL-4、TNF-α、IFN-γ、IL-17 水平。

2.4 肝臟、脾臟、胸腺和結腸指數 取出肝、脾、胸腺、結腸后，生理鹽水涮洗干凈后用濾紙將多余液體吸附，稱定質量，計算相應臟器指數，臟器指數＝臟器質量／體質量。

2.5 結腸黏膜損傷指數評分 肉眼觀察結腸組織黏膜損傷情況，參照Luk 等［10］標準進行結腸黏膜損傷指數（Colonmucosa damage index，CMDI） 評分。

2.6 結腸EGF、TGF-β1、MPO 水平測定 取結腸病變部位組織0.15 g，生理鹽水按1∶9比例勻漿，離心后取上清液，ELISA 法檢測EGF、TGF-β1 水平，試劑盒檢測MPO水平。

2.7 結腸病理形態觀察 取約0.5 cm×0.5 cm 病變部位結腸，福爾馬林溶液固定，HE 染色，光學顯微鏡下觀察病理切片，參照Ekstr?m 等［11］標準并進行結腸結腸病理形態觀察評分（histopathological score，HS）。

2.8 統計學分析 采用SPSS 20.0 進行分析。數據以（）表示，服從正態分布，多組間比較采用單因素方差分析；不服從正態分布，采用秩和檢驗，以P≤0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 美洲大蠊提取物對UC 大鼠DAI 評分的影響 建模后第1 天，與正常對照組比較，其余各組大鼠出現毛色無光澤、少動嗜睡、厭食、大便隱血或血便等現象。給藥第1天各造模組大鼠DAI 評分較正常對照組升高（P＜0.01）。給藥第14 天，模型組DAI 評分較正常對照組仍升高（P＜0.01），提示模型持續存在；經柳氮磺胺吡啶、腸炎寧、美洲大蠊提取物干預后，大鼠糞便部分由水樣稀便轉為較松散稀便，糞便隱血減少，活動增強、體質量增加；與模型組比較，美洲大蠊提取物組和柳氮磺胺吡啶組DAI評分降低（P＜0.01）；與腸炎寧組比較，美洲大蠊提取物低、中劑量組DAI 評分降低（P＜0.01）；與柳氮磺胺吡啶組比較，美洲大蠊提取物中劑量組DAI 評分降低（P＜0.05）。見表1。

表1 美洲大蠊提取物對UC 大鼠DAI 評分的影響（， n＝10）

表1 美洲大蠊提取物對UC 大鼠DAI 評分的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P ＜0.05；與腸炎寧組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

3.2 美洲大蠊提取物對UC 大鼠臟器指數的影響 如表2所示，與正常對照組比較，模型組結腸指數升高（P＜0.01），肝臟、脾臟、胸腺指數無影響。美洲大蠊提取物組大鼠結腸指數較模型組、柳氮磺胺吡啶組和腸炎寧組降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 美洲大蠊提取物對UC 大鼠臟器指數的影響（mg／g，， n＝10）

表2 美洲大蠊提取物對UC 大鼠臟器指數的影響（mg／g，， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與腸炎寧組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

3.3 美洲大蠊提取物對UC 大鼠CMDI 評分的影響 如表3、圖1 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠腸壁有明顯充血、水腫、潰瘍形成，結腸黏膜病變嚴重，結腸長度和長寬比減小，CMDI 評分升高（P＜0.01）；與模型組比較，美洲大蠊提取物低劑量組結腸長度升高（P＜0.01），美洲大蠊提取物各劑量組結腸長寬比升高、CMDI 評分降低（P＜0.05，P＜0.01）；與柳氮磺胺吡啶組比較，美洲大蠊提取物各劑量組結腸長寬比升高（P＜0.01），CMDI 評分下降（P＜0.01）。

表3 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結腸CMDI 評分的影響（， n＝10）

表3 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結腸CMDI 評分的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與腸炎寧組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01。

圖1 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結腸黏膜的影響

3.4 美洲大蠊提取物對UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響 如表4 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清IL-4 水平降低 （P＜0.01），TNF-α、IL-17、IFN-γ水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清IFN-γ、TNF-α 水平降低（P＜0.01）；腸炎寧組和美洲大蠊提取物低、中劑量組IL-4 水平升高（P＜0.01）；除美洲大蠊提取物PABA1 低劑量組外，其他給藥組IL-17水平降低（P＜0.01）。與柳氮磺胺吡啶組比較，美洲大蠊提取物各劑量組TNF-α、IL-17 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），低、中劑量組IL-4 水平升高（P＜0.05）；與腸炎寧組比較，美洲大蠊提取物各劑量組IL-17 水平降低（P＜0.01）。

表4 美洲大蠊提取物對UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響（， n＝10）

表4 美洲大蠊提取物對UC 大鼠血清IL-4、IL-17、TNF-α、IFN-γ 水平的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與腸炎寧組比較，▽▽P＜0.01。

3.5 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結腸EGF、TGF-β1、MPO水平的影響 如表5 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠結腸EGF、TGF-β1 水平降低，MPO 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，美洲大蠊提取物各劑量組EGF、TGF-β1 水平升高（P＜0.01），美洲大蠊提取物中劑量組MPO 降低（P＜0.01）；與硫柳氮磺胺吡啶組和腸炎寧組比較，美洲大蠊提取物各劑量組EGF 水平升高（P＜0.01）。

表5 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結腸EGF、TGF-β1 及MPO 水平的影響（， n＝10）

表5 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結腸EGF、TGF-β1 及MPO 水平的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與腸炎寧組比較，▽▽P＜0.01。

3.6 美洲大蠊提取物對UC 大鼠結腸病理組織學的影響如表6、圖2 所示，除正常對照組外，其他組大鼠結腸黏膜呈不同程度潰瘍并伴有炎性細胞浸潤。模型組結腸HS評分高于正常對照組（P＜0.01）。美洲大蠊提取物各劑量組結腸HS 評分較模型組和硫柳氮磺胺吡啶組降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 美洲大蠊提取物對UC 大鼠HS 評分的影響（， n＝10）

表6 美洲大蠊提取物對UC 大鼠HS 評分的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與柳氮磺胺吡啶組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與腸炎寧組比較，▽P＜0.05。

4 討論

由三硝基苯磺酸／乙醇法誘導UC 大鼠模型是一種公認的造模方法。乙醇介導腸黏膜屏障破損，三硝基苯磺酸與腸黏膜組織蛋白結合成完全抗原，使T 淋巴細胞致敏，引起腸壁免疫應答和炎癥反應［12］，其中CD4＋T 淋巴細胞引起的腸道損傷具有特征性和復發性。CD4＋T 淋巴細胞分為Th1 和Th2 亞群，Th1 可誘發遲發型超敏反應，觸發免疫反應及炎癥發生，Th2 可降低機體免疫反應。在外來抗原刺激下，Th1、Th2 細胞激活并分化，其平衡狀態破壞，導致免疫功能紊亂［13］。本實驗采用三硝基苯磺酸／乙醇法誘導大鼠潰瘍性結腸炎，各造模組大鼠于給藥第1 天其DAI 較正常對照組均顯著增加，給藥結束時模型組DAI 評分較正常對照組仍顯著增加，提示模型持續存在，經美洲大蠊提取物治療后與模型組、柳氮磺胺吡啶組和腸炎寧組相比其DAI 均降低。

圖2 HE 染色檢測各組大鼠結腸病理組織學（×100）

TNF-α 由Th1 細胞和中性粒細胞分泌釋放，具有增加腸道上皮細胞通透性，啟動病理性Th1 介導的細胞免疫，破壞腸粘膜屏障功能［14］，促進Th1 分泌產生INF-γ，進而激活吞噬細胞及中性粒細胞，加重炎性反應。模型組TNF-α、IFN-γ 水平升高，經美洲大蠊提取物治療后抑制TNF-α、IFN-γ 表達，減緩炎癥，且美洲大蠊提取物治療后TNF-α 與腸炎寧組表達相當，較柳氮磺胺吡啶組降低。IL-4 由Th2 型細胞分泌，通過抑制IFN-γ、TNF-α 產生，達到抑制炎癥反應并維持腸道免疫平衡的作用。美洲大蠊提取物治療后血清IL-4 水平顯著升高，說明美洲大蠊提取物能通過增強抑制炎癥達到回調Th1／Th2 失衡的作用。

IL-17 主要是由CD4＋T 細胞分泌促炎效應因子，可活化T 細胞和刺激巨噬細胞產生多種炎癥因子，在炎癥發生過程中起重要調控作用［15］。MPO 由中性粒細胞分泌，其含有量升高會導致炎性細胞增殖和活化，導致炎癥部位組織細胞損傷，其活性間接反映腸道炎癥程度［16］。EGF、TGF-β1可促使分化基因表達及誘導細胞生長遷移，維持上皮細胞正常新陳代謝［17-18］，實驗結果顯示模型組EGF 和TGF-β1 水平顯著下降，經美洲大蠊提取物治療后UC 大鼠結腸長度增長，CMDI 評分減少，上皮細胞恢復、炎性細胞浸潤程度降低，與結腸組織中EGF、TGF-β1 升高趨勢一致，提示美洲大蠊提取物能刺激細胞生長修復從而促進腸黏膜屏障功能恢復。但是美洲大蠊提取物各劑量組療效有所差別，推測經灌胃給藥后，美洲大蠊提取物可能通過多成分、多靶點、多途徑發揮治療作用使實驗呈非線性結果［19］，后期將深入研究美洲大蠊提取物的量效關系。