尿石素A 對2 型糖尿病小鼠脂肪組織胰島素抵抗的影響

楊 柳，田亞麗，古麗海夏哈勒瑪合拜，巴合提別克，張 燕，張?之*

（1.新疆醫科大學，新疆烏魯木齊 830011； 2.新疆醫科大學藥學院藥理教研室，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆醫科大學一附院，國家高發病重點實驗室，新疆烏魯木齊 830011； 4.新疆軍區烏魯木齊總醫院，新疆烏魯木齊 830002）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR） 作為2 型糖尿病的主要發病基礎，越來越受到重視。脂肪組織是胰島素的靶器官，也是內分泌器官，能釋放游離脂肪酸［1］、抵抗素［2-3］、脂聯素［4］、腫瘤壞死因子-α 等脂肪細胞因子來影響葡萄糖及脂質代謝，在胰島素抵抗中有重要角色。

尿石素A 是石榴、草莓、黑莓及胡桃等水果或堅果中鞣花酸經腸道菌群作用產生的活性代謝產物，具有抗炎［5］、抗自由基［6］、胰臟保護作用［7］。Ryu 等［8］證明尿石素A 在促進自噬方面表現出獨特的作用，可使秀麗隱桿線蟲壽命延長。有研究［9-10］發現尿石素A 能通過提高線粒體功能改善胰島素抵抗，但機制仍不清楚。因此本研究提出假設，尿石素A 可能通過影響脂肪組織胰島素信號及自噬改善糖尿病狀態下脂肪組織胰島素抵抗，并進行驗證。

1 材料

1.1 儀器 血糖儀及試紙條（上海羅氏制藥有限公司）；Multiskan go 型酶標儀（美國熱電公司）；HB-P2 型組織包埋機（武漢漢谷醫療科技有限公司）；RM2235 型切片機（德國徠卡公司）；BX43 型顯微鏡［奧林巴斯（中國） 有限公司］；動物專用電子天平［東西儀（北京） 科技有限公司］。

1.2 試劑與藥物 尿石素A （UA） （純度≥98%，批號ZZS17112001） 購自上海甄準生物有限公司；鏈脲佐菌素（STZ，批號WXBC1125V） 購于美國Sigma 公司；氯喹（CQ，批號171114） 購自武漢鼎暉生物科技有限公司；小鼠甘油三酯（TG，批號180502A）、空腹胰島素（FINS，批號180601C）、低密度脂蛋白（LDL-C，批號180502A）、高密度脂蛋白 （HDL-C，批號180502A）、游離脂肪酸（FFA，批號180601A）、脂聯素（ADPN，批號180602B）、抵抗素（Resistin，批號180602B） ELISA 試劑盒購自上海優選生物科技有限公司；RIPA 細胞裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；蛋白免疫印跡試劑盒購自北京鼎國生物科技公司；IRS1、p-AKT、Glut4 抗體購自美國CST公司。

1.3 動物與飼料 SPF 級雄性C57BL／ 6 小鼠40 只，體質量（24±2） g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，使用許可證號SYXK （新） 2016-0002。基礎飼料由新疆醫科大學動物實驗中心實驗室提供，總熱量25 kJ／kg （蛋白質13%、碳水化合物53%、脂肪6%）；高脂飼料（脂肪60%） 購自南通特洛菲飼料有限公司。動物實驗得到新疆醫科大學實驗動物管理與使用委員會的批準。

2 方法

2.1 造模與分組 C57BL／6 小鼠給予普通飼料適應性喂養1 周，隨機分為正常組、模型組、尿石素A 組、尿石素A＋氯喹組，每組10 只。除正常組，其余3 組均給予高脂飼料喂養6 周，腹腔注射80 mg／kg STZ 2 次建立糖尿病胰島素抵抗模型。正常組、模型組灌胃給予生理鹽水，尿石素A組灌胃給予尿石素A （50 mg／kg），尿石素A＋氯喹組給予尿石素A （5 mg／kg） 灌胃同時腹腔注射氯喹（5 mg／kg），給藥8 周。

2.2 血漿指標檢測 給藥8 周后，禁食12 h，稱定質量、麻醉、眼眶取血，3 000 r／min 離心得到血漿，測定血漿TG、LDL、HDL、空腹游離脂肪酸 （FFA）、空腹胰島素（FINS）、ADPN、Resistin 水平。計算體脂比，體脂比＝［（腎周脂肪質量＋附睪脂肪質量） ／體質量］×100%，空腹脂肪組織胰島素抵抗指數（FIRI） ＝空腹FFA×空腹胰島素。

2.3 脂肪組織病理形態學觀察 附睪脂肪取一部分固定于10%多聚甲醛溶液中48 h 后脫水，常規石蠟包埋切片，切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，伊紅染色，蘇木精復染，梯度脫水，二甲苯透明，樹脂封片，電鏡下觀察。

2.4 Western blot 檢測蛋白表達 將各組脂肪組織樣品，用RIPA 裂解液裂解后提取總蛋白，BCA 定量后，加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min。取40 μg 總蛋白，SDSPAGE 電泳后電轉于硝酸纖維膜，加入一抗（1∶1 000）4 ℃下孵育過夜，加入二抗（1∶4 000） 孵育1 h。ECL 發光法檢測目的蛋白表達。

2.5 統計學分析 用SPSS 22.0 軟件進行分析，計量資料以（） 表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 尿石素A 對糖尿病小鼠體質量的影響 與正常組比較，糖尿病組小鼠終體質量降低（P＜0.01）；與模型組比較，尿石素A 組小鼠終體質量略升高，但差異無統計學意義，尿石素A＋氯喹組小鼠終體質量降低（P＜0.01）；與尿石素A 組比較，尿石素A＋氯喹組終體質量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 尿石素A 對糖尿病小鼠體質量的影響（g，，n＝10）

表1 尿石素A 對糖尿病小鼠體質量的影響（g，，n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與尿石素A 組比較，ΔP＜0.05。

3.2 尿石素A 對糖尿病小鼠臟器周脂肪質量、體脂比的影響 與正常組比較，模型組的體脂比略有降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，尿石素A 組、尿石素A＋氯喹組體脂比略有升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 尿石素A 對糖尿病小鼠臟器周脂肪質量、體脂比的影響（， n＝10）

表2 尿石素A 對糖尿病小鼠臟器周脂肪質量、體脂比的影響（， n＝10）

3.3 尿石素A 對糖尿病小鼠血漿TG、LDL、HDL 水平的影響 與正常組比較，模型組血漿TG、LDL 均升高（P＜0.01），HDL 降低（P＜0.01）；與模型組比較，尿石素A 組LDL 降低，HDL 升高（P＜0.01），TG 降低（P＜0.01），尿石素A＋氯喹組TG、LDL 均降低（P＜0.01），HDL 升高（P＜0.05）；與尿石素A 組比較，尿石素A＋氯喹組TG 降低（P＜0.01）。見表3。

表3 尿石素A 對糖尿病小鼠血脂的影響（， n＝10）

表3 尿石素A 對糖尿病小鼠血脂的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尿石素A 組比較，△△P＜0.01。

3.4 尿石素A 對糖尿病小鼠血漿FFA、FINS、FIRI 的影響 與正常組比較，模型組小鼠空腹FFA、FINS、FIRI 均增高（P＜0.01）；與模型組比較，尿石素A 組空腹FFA、FIRI 均降低 （P＜0.01），尿石素A ＋氯喹組空腹FFA、FINS、FIRI 均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 尿石素A 對糖尿病小鼠血漿FFA、FINS、FIRI 的影響（， n＝10）

表4 尿石素A 對糖尿病小鼠血漿FFA、FINS、FIRI 的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.5 尿石素A 對糖尿病小鼠血漿ADPN、Resistin 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血漿ADPN 水平降低，Resistin水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，尿石素A 組小鼠血漿ADPN 水平升高，Resistin 水平降低（P＜0.01），尿石素A＋氯喹組ADPN 水平升高（P＜0.01），Resistin 水平降低（P＜0.01）。見表5。

表5 尿石素A 對糖尿病小鼠血漿ADPN、Resistin 水平的影響（， n＝10）

表5 尿石素A 對糖尿病小鼠血漿ADPN、Resistin 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.6 尿石素A 對糖尿病小鼠脂肪組織病理形態結構的影響與正常組比較，模型組小鼠可見淋巴結，部分脂肪細胞變大變圓；與模型組比較，尿石素A 組小鼠脂肪細胞不飽滿，細胞膜皺縮，尿石素A＋氯喹組小鼠脂肪有小灶壞死，部分區可見少許炎細胞浸潤。見圖1。

圖1 尿石素A 對糖尿病小鼠脂肪組織病理形態結構的影響（HE，×200）

3.7 尿石素A 對糖尿病小鼠脂肪組織胰島素信號的影響 與正常組比較，模型組小鼠脂肪組織IRS1、p-Akt、Glut4 蛋白表達下調（P＜0.01）；與模型組比較，尿石素A組小鼠脂肪組織IRS1、p-Akt、Glut4 表達上調（P＜0.01），信號通路活性增強；與尿石素A 組比較，尿石素A＋氯喹組脂肪組織IRS1、p-Akt、Glut4 表達下調 （P＜0.05）。見圖2。

圖2 尿石素A 對糖尿病小鼠脂肪組織胰島素信號的影響

3.8 尿石素A 對糖尿病小鼠脂肪組織自噬蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠脂肪組織LC3 Ⅱ／I、Beclin1 蛋白表達增強 （P＜0.01），p62 蛋白表達減弱（P＜0.01）；與模型組比較，尿石素A 組小鼠脂肪組織LC3Ⅱ／I、Beclin1 蛋白表達減弱（P＜0.05），p62 蛋白表達增強（P＜0.01）；與尿石素A 組比較，尿石素A＋氯喹組小鼠脂肪組織Beclin1、p62 蛋白表達減弱（P＜0.05）。見圖3。

圖3 尿石素A 對糖尿病小鼠脂肪組織自噬蛋白表達的影響

4 討論

胰島素抵抗是2 型糖尿病的重要特征，脂肪組織胰島素抵抗表現為胰島素轉導信號異常導致胰島素促進脂肪合成作用被嚴重抑制，脂肪分解代謝加強，出現血清游離脂肪酸（FFA） 水平升高等脂肪代謝異常的典型表現，也是肥胖引起胰島素抵抗的主要因素之一［11］。臨床研究發現，血清脂聯素水平在肥胖、胰島素抵抗伴肥胖患者中逐漸降低，提示脂聯素是聯系肥胖和胰島素抵抗的紐帶［12］；抵抗素作為一種脂肪激素，可引起并參與炎癥反應，還可引發脂肪細胞的胰島素抵抗［13］。因此改善脂肪組織胰島素信號，調節異常的脂質代謝及脂肪細胞因子紊亂是改善胰島素抵抗的重要措施。

本實驗發現尿石素A 灌胃8 周顯著降低c57BL／6 糖尿病小鼠血漿空腹FFA、LDL、Resistin 水平，顯著升高HDL、ADPN 水平，脂肪組織胰島素抵抗指數降低也進一步證實尿石素A 具有顯著改善糖尿病小鼠胰島素抵抗的作用。糖尿病小鼠脂肪細胞體積增大，大脂肪細胞數量增多，與李國生等［14］觀察結果一致。尿石素A 干預的小鼠脂肪組織細胞不飽滿，細胞膜皺縮，脂肪細胞變小變瘦，以上結果揭示尿石素A 可能通過改善脂肪組織病理，影響其分泌的脂肪因子水平，糾正糖尿病模型小鼠血脂紊亂，從而改善了IR。Toney 等［10］研究顯示高脂小鼠腹腔注射尿石素A 能使血漿總膽固醇、LDL 顯著降低，TG 降低無統計學意義，ADPN 顯著升高，與本實驗結果一致。

胰島素發揮正常生理作用依賴于胰島素與其細胞膜受體結合及結合后完整的信號傳導。胰島素受體是一個異四聚體，表達于肝臟、脂肪和骨骼肌的細胞膜上［15］。胰島素受體信號系統包括胰島素受體（insulin receptor，IR）、胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS） 家族、磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidy linositol-3-kinase，PI3K） 及其下游的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶 （serinethreonine kinase，Akt）、Ras、Raf、MAPK （絲裂原激活蛋白激酶） 等［16］。脂肪組織中的葡萄糖轉運體4 （GLUT4） 作為重要的胰島素信號轉導應答器。在T2D 患者脂肪細胞中發現Glut4 減少［17］，轉基因小鼠Glut4 基因消融或雜合敲除特別是在脂肪細胞中，導致全身胰島素抵抗最后進展為糖尿病［18］。尿石素A 干預可使脂肪組織中IRS1／p-Akt／Glut4 信號通路活性顯著增強，提高脂肪組織對胰島素的敏感性，促進其攝取葡萄糖，從而改善胰島素抵抗狀態，而自噬抑制劑氯喹反轉了尿石素A 激活胰島素信號通路的作用。

自噬是自噬體小泡包裹受損的細胞器或錯誤折疊的蛋白質，并把它們遞送給溶酶體分解的過程［19］。LC3Ⅱ／I 是自噬關鍵蛋白，Beclin 1 是自噬始發過程的指標，p62 作為選擇性自噬接頭蛋白，其UBA、LIR 結構域的磷酸化使p62靶向結合于泛素化蛋白聚合物并通過自噬作用被溶酶體選擇性降解。自噬在正常生理狀態下存在平衡，即自噬過程由自噬激活和自噬抑制加以調節平衡，任一方面失衡自噬可能發生異常，過分刺激或不利環境下，自噬可能演變為不良的自噬反應，即過度自噬或自噬障礙，均可擾亂正常自噬，從而嚴重影響組織細胞功能。低度炎癥，氧化應激和內質網應激，胰島素抵抗和脂肪組織低氧，這些存在于肥胖和糖尿病中的因素可以激活自噬［20］。動物體內和體外對脂肪組織的研究發現，在肥胖和胰島素抵抗鼠的脂肪組織中自噬的活性升高［21］，Ost 等［22］首次發現肥胖和糖尿病人群來源的脂肪細胞中自噬成分LC3 增加。吳彥菊等［23］在T2D 的小鼠模型中發現，與正常組相比，糖尿病組小鼠胰島β 細胞BeclinlmRNA 表達顯著增加。本實驗顯示，與正常組比較，糖尿病小鼠脂肪組織自噬紊亂，Beclin1、LC3Ⅱ表達顯著增強，p62 蛋白表達顯著減弱，顯示自噬過度激活，而且伴隨胰島素信號通路被抑制；尿石素A 可糾正這種自噬蛋白異常表達向正常方向恢復，而且胰島素信號通路激活，胰島素抵抗狀態改善。Rocha 等［24］研究發現，8周耐力運動干預后不但可以顯著降低肥胖大鼠體質量、內臟脂肪系數，還能使附睪脂肪細胞自噬蛋白標志物LC3Ⅱ和Beclin1 蛋白表達顯著下降，提示長期耐力訓練能降低肥胖大鼠的脂肪細胞異常自噬活性，這與UA 的作用相似，提示了尿石素A 對自噬的有益調節作用。氯喹是一種自噬抑制劑，抑制自噬體與溶酶體融合階段，嚴重阻礙自噬流，聯用氯喹后脂肪組織胰島素IRS1／p-Akt／Glut4 信號通路顯著被抑制，說明自噬過度激活或自噬過程障礙均可導致脂肪組織胰島素抵抗。

氯喹在臨床上用于控制瘧疾癥狀，還可用于治療腸道外阿米巴病及肝膿瘍、類風濕性關節炎、紅斑性狼瘡及腎病綜合征等。本實驗發現，與單獨尿石素A 干預比較，聯合氯喹后糖尿病小鼠體質量減輕，血漿甘油三酯水平降低，說明氯喹和尿石素A 具有協同降低血漿TG 的作用，但前期研究發現尿石素A 明顯改善肝脂肪變，加用氯喹使肝臟TG 增加，肝臟脂肪變加重，提示盡管氯喹降低血漿TG，但可能增加了TG 的肝異位沉積。

綜上所述，尿石素A 可以作用于脂肪組織，改變脂肪組織分泌的脂肪細胞因子水平，調節糖尿病小鼠血脂代謝，通過糾正過度自噬，激活脂肪組織IRS1／p-AKT／Glut4 胰島素信號通路，從而減輕糖尿病小鼠胰島素抵抗。