大鼠腸道菌群對(duì)苦丁茶冬青皂苷D 體外代謝的影響

白春艷，吳三同，張雅瓊，顧 雯，張加余，程景平，饒高雄*，車彥云*

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南省高校藥食同源養(yǎng)生產(chǎn)品工程研究中心，云南昆明 650500； 2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明市代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500； 3.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東煙臺(tái) 264003）

苦丁茶冬青是冬青科Aquifoliaceae 冬青屬植物苦丁茶冬青Ilex kudingchaC.J.Tseng 嫩葉或葉，味苦、甘，性涼，入肝、肺、胃經(jīng)，有清暑、解毒、生津的功效［1-2］。苦丁茶冬青皂苷D （kudinoside D） 是苦丁茶冬青中的主要活性成分，在體外顯示出抑制3T3-L1 細(xì)胞內(nèi)脂滴形成和脂質(zhì)沉積的作用，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能降低ApoE-／-小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積大小和膽固醇水平，提示其具有降脂減肥和抗動(dòng)脈粥樣硬化的生物活性［3-4］。

多種天然產(chǎn)物成分口服后，會(huì)與胃腸道中的酶或微生物進(jìn)行接觸。尤其是分子量較大的皂苷類口服后，可被腸道菌群代謝，轉(zhuǎn)化為可能比原形成分具有更強(qiáng)生物活性或更好生物利用度的成分［5-6］。因此，研究天然產(chǎn)物成分與腸道菌群的代謝具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)采用離體腸道菌孵育的方法，將冬青皂苷D 用大鼠腸道菌的培養(yǎng)液在厭氧條件下溫孵，采用UPLC-HR-MSn 技術(shù)檢測(cè)分析其在大鼠腸道菌群中的代謝情況，并推測(cè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，探討體外腸道菌群對(duì)其代謝轉(zhuǎn)化的一般規(guī)律，以期為苦丁茶冬青的體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 30 只清潔級(jí)健康SD 雄性大鼠，8 周齡，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘） 2016-01002。

1.2 試劑與藥物 苦丁茶冬青葉藥材采集自廣西大新，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)饒高雄教授鑒定為冬青科植物苦丁茶Ilex kudingcha的干燥葉，其憑證標(biāo)本保存于云南省高校藥食同源養(yǎng)生產(chǎn)品工程研究中心。冬青皂苷D 是課題組從苦丁茶葉70%乙醇提取物中制備得到［3］，經(jīng)HPLC 歸一化法檢測(cè)，純度≥98%。厭氧培養(yǎng)基（批號(hào)20161207） 購自青島日水生物技術(shù)有限公司；厭氧培養(yǎng)袋（批號(hào)20181225）、厭氧產(chǎn)氣包（批號(hào)20180823） 購自上海哈靈生物科技有限公司。乙腈（美國Fisher Scientific 公司）；甲酸（美國Sigma公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 Waters Acquity I-Class 超高效液相色譜儀、Waters Xevo G2 QTof 質(zhì)譜、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm） 購自美國Waters 公司；Synergy UV 型超純水機(jī)（美國Millipore 公司）；恒溫培養(yǎng)箱（三洋電機(jī)株式會(huì)社）；MTN-2800D 氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；SX-500 高壓滅菌鍋（日本Tomy 公司）；ALLEGRA X-30R 離心機(jī)（美國Beckman Coulter 公司）。

2 方法

2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相水（含0.1%甲酸）（A） -甲醇（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脫（0～2 min，10%B；2～6 min，10%～50%B；6～20 min，50%～80%B）；體積流量0.4 mL／min；柱溫45 ℃；檢測(cè)波長226、260 nm；進(jìn)樣量1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 正離子模式，毛細(xì)管電壓1 000 V；離子源溫度100 ℃；樣品錐電壓20 eV；霧化氣、干燥氣氮?dú)猓兌龋?9.99%）；碰撞氣氦氣（純度＞99.99%）；體積流量10 L／min；掃描模式MSE，質(zhì)量范圍50～1 300 Da；低能量6 eV；高能量30～90 eV。

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取冬青皂苷D 對(duì)照品12.8 mg，溶于10 mL 甲醇中，制成1.28 mg／mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 供試品溶液制備 精密稱取冬青皂苷D 對(duì)照品39 mg，加入500 μL DMSO 使其完全溶解，再加入無菌水定容至10 mL，放于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 厭氧培養(yǎng)基的配制 稱取GAM 肉湯粉末約10 g 于500 mL 燒杯中，加入適量蒸餾水，水浴加熱攪拌使其完全溶解，冷卻后轉(zhuǎn)移到1 000 mL 容量瓶中，加蒸餾水定容至1 000 mL。將配制好的培養(yǎng)基放置于高壓滅菌鍋中，0.1 MPa、121 ℃滅菌15 min，滅菌后取出冷卻備用［7］。

2.6 大鼠腸道菌群孵育液的制備 SD 大鼠適應(yīng)性的喂養(yǎng)1周，取其新鮮糞便3.5 g，按1∶4 （質(zhì)量：體積） 比例加入生理鹽水，渦旋，制成混懸液，4 000 r／min離心10 min。取上清液按1∶9 比例加入滅菌培養(yǎng)基混勻，恒溫振蕩器中厭氧培養(yǎng)24 h （37 ℃、150 r／min），即得［8］。

2.7 苦丁茶冬青皂苷D 在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中的代謝 精密量取“2.4”項(xiàng)下的冬青皂苷D 供試品溶液3 mL至離心管中，加入27 mL 雄鼠腸道菌群孵育液，混勻，將溶液分裝（每管1 mL），同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組（冬青皂苷D對(duì)照品溶液＋厭氧培養(yǎng)液） 和空白對(duì)照組（不加冬青皂苷D 的大鼠腸道菌群孵育液），每組重復(fù)3 份。將各組裝入?yún)捬醮忻芊猓?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱密閉培養(yǎng)0、8、24、48、96 h，取出，加入1 mL 乙酸乙酯-水飽和正丁醇（1∶1）渦旋3 min，10 000 r／min 離心10 min，分別取500 μL 上清液置于1.5 mL 離心管，置于氮吹儀上，37 ℃水浴氮?dú)饬鞔蹈伞堅(jiān)眉状既芙舛ㄈ葜? mL，10 000 r／min 離心10 min，吸取上清液，稀釋后進(jìn)行UPLC-MS 檢測(cè)。

3 結(jié)果

將苦丁茶冬青皂苷D 在大鼠腸道菌培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物于UPLC-MS 檢測(cè)，通過分析其中各成分的相對(duì)分子質(zhì)量和保留時(shí)間，并結(jié)合提取離子流圖、各成分質(zhì)譜信息及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定。孵育96 h 后的代謝物總離子流圖（圖1A） 結(jié)果顯示，冬青皂苷D （M1）主要有4 種體外代謝產(chǎn)物（表1），分別是ilekudinoside P（M2）、kudinoside LZ11（M3）、3-O-α-L-arabinopyranosyl-αku-dinlactone （M4）、α-kudinlactone （M5）。比較不同培養(yǎng)時(shí)間樣品的代謝物總離子流圖（圖1B），發(fā)現(xiàn)不同代謝時(shí)間點(diǎn)的代謝產(chǎn)物種類有差別，如化合物M3 在培養(yǎng)8 h 就可以檢測(cè)到，M2 和M5 在培養(yǎng)24 h 可以檢測(cè)到，M4 在培養(yǎng)96 h 后才可以檢測(cè)到，推測(cè)可能是由于單糖苷（M4） 在代謝物中含有量較低的原因。

表1 苦丁茶冬青皂苷D 及其大鼠腸道菌群代謝產(chǎn)物的鑒定分析

3.1 苦丁茶冬青皂苷D 代謝底物和代謝產(chǎn)物鑒別 將正常實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組進(jìn)行比較，根據(jù)正離子模式MS 及MS／MS 譜圖，推測(cè)可能的原型成分、代謝產(chǎn)物。從大鼠腸道菌群與苦丁茶冬青皂苷D 的體外培養(yǎng)物中，鑒定出其原型成分和4 個(gè)代謝產(chǎn)物。

化合物M1 為苦丁茶冬青皂苷D，在UPLC 中化合物M1 與冬青皂苷D 具有相同的保留時(shí)間（11.2 min），在質(zhì)譜中顯示準(zhǔn)分子離子［M ＋H］＋為m／z909.49，［M＋Na］＋為m／z931.47，且主要碎片離子峰與標(biāo)準(zhǔn)品一致（圖2A）。在正離子模式下，冬青皂苷D 生成的碎片離子主要有m／z747.43、601.38、469.33、451.32、推斷它們分別為［M＋H-Glc］＋、［M＋H-Glc-Rha］＋、［M＋H-Glc-Rha-Ara］＋、［M＋H-Glc-Rha-Ara-H2O］＋。

化合物M2 的保留時(shí)間是11.65 min （圖1 A），在ESIMS 正離子模式（圖2B） 中顯示m／z785.40 ［M ＋Na］＋、763.34 ［M＋H］＋，與化合物M1 相比失去了146 Da。同時(shí)，在質(zhì)譜圖中與化合物M1 顯示相同的碎片離子峰m／z601.38、469.32、451.32，推測(cè)化合物M2 與M1 具有相同的結(jié)構(gòu)母核，結(jié)合分子量和極性，推測(cè)它為M1 失去阿拉伯糖基的產(chǎn)物，鑒定為苦丁茶冬青苷P （ilekudinoside P）。

化合物M3 的保留時(shí)間是12.07 min （圖1A），在ESIMS 正離子模式（圖2C） 中顯示［M＋Na］＋為m／z769.40，［M＋H］＋為m／z747.41，與化合物M1 比較失去了162 Da。質(zhì)譜圖中顯示與化合物M1 相同碎片離子峰m／z601.38、469.33、451.32，推測(cè)M3 與其具有相同的結(jié)構(gòu)母核，結(jié)合分子量和極性，推測(cè)它為M1 失去葡萄糖基的產(chǎn)物，鑒定為苦丁茶冬青皂苷LZ11（kudinoside LZ11）。

化合物M4 的保留時(shí)間是12.34 min （圖1A），在ESIMS 正離子模式（圖2D） 中顯示m／z623.42 ［M ＋Na］＋、601.38 ［M＋H］＋，與化合物M1 相比失去了308 Da（圖3），與化合物M2 相比失去了162 Da，與化合物M3 相比失去了146 Da。同時(shí)，在質(zhì)譜圖中觀察到與M1 相同的碎片離子峰m／z451.24，推測(cè)它為M1 失去葡萄糖基和阿拉伯糖基的產(chǎn)物，鑒定為3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-α-苦丁內(nèi)酯（3-O-α-L-arabinopyranosyl-α-kudinlactone）。

圖1 苦丁茶冬青皂苷D （A）及其代謝物（B） 正離子模式圖

化合物M5 的保留時(shí)間是13.89 min （圖1 A），在ESIMS 正離子模式 （圖2E） 中顯示491.31 ［M ＋ Na］＋、451.32 ［M＋H］＋，與化合物M1 比較失去了葡萄糖基、鼠李糖基、阿拉伯糖基，結(jié)合分子量和極性，鑒定它為化合物M1 的苷元α-苦丁內(nèi)酯（α-kudinlactone）。

3.2 苦丁茶冬青皂苷D 代謝途徑分析 由代謝產(chǎn)物的鑒定結(jié)果可知，苦丁茶冬青皂苷D 在大鼠腸道菌群代謝作用下主要發(fā)生脫糖基反應(yīng)（圖3）。冬青皂苷D 與腸道菌群共孵育后，會(huì)脫去末端的支鏈糖（鼠李糖基或葡萄糖基），代謝為二糖苷苦丁茶冬青苷P 和苦丁茶冬青皂苷LZ11，繼續(xù)水解轉(zhuǎn)化為單糖苷，最終代謝生成苷元。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)以苦丁茶冬青皂苷D 與離體大鼠腸道菌群厭氧共孵育，采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS／MS 進(jìn)行代謝產(chǎn)物的分析。根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量數(shù)據(jù)和特征離子碎片，鑒定其中4 種主要代謝產(chǎn)物，推測(cè)代謝途徑主要是脫去糖基反應(yīng)。

腸道菌群是影響中藥皂苷類成分口服吸收的重要因素，例如人參皂苷（Ginsenosides）［9-10］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腸道菌群的組成也會(huì)影響皂苷類成分的代謝過程和代謝產(chǎn)物，例如羅漢果中的皂苷類成分［11］，因此分別研究正常與疾病動(dòng)物模型體內(nèi)皂苷的代謝轉(zhuǎn)化對(duì)于了解皂苷的吸收具有重要的指導(dǎo)意義。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)苦丁茶冬青皂苷D 可被離體大鼠腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化，其在動(dòng)物體內(nèi)受腸道菌群影響的代謝轉(zhuǎn)化還需進(jìn)一步研究，以便深入了解其藥理作用機(jī)制。

圖2 化合物M1 （A）、M2 （B）、M3 （C）、M4（D）、M5 （E） ESI-MS 色譜圖

圖3 苦丁茶冬青皂苷D 與SD 大鼠腸道菌群共孵育發(fā)生的代謝途徑