植物非經典生長素信號轉導通路解析

馬軍 徐通達

（福建農林大學海峽聯合研究院 園藝植物生物學與代謝組學研究中心，福州 350007）

生長素英文名為“auxin”，取自希臘語“auxein”，意思是“生長”。生長素是最早被人們發現的一類植物激素，早在1880年，達爾文（Darwin）就發現植物的向光性生長依賴于其頂端產生的某種化學物質，該物質移動到下部組織并促使植物向光彎曲生長［1］。1926年，Went等［2］通過瓊脂塊擴散的方式從植物組織中分離到具有促進生長特性的化學物質。直到1946年，Haagen-Smit等［3］分離純化并解析其化學結構為吲哚乙酸，是植物中生長素存在的主要形式。隨后的大量研究發現生長素在植物生長發育的各個過程起著至關重要的調控作用［4-5］。植物主要通過協調生長素的合成代謝［6-7］、極性運輸［8］以及信號轉導［9］來實現其復雜多樣的功能。

信號轉導是將上游信號轉換為下游復雜反應的重要過程。在細胞核內，泛素酶復合體關鍵蛋白TIR1/AFB蛋白被證明是生長素受體。生長素特異性地促進SCFTIR1/AFB-Aux/IAA蛋白復合體的形成從而導致Aux/IAA轉錄抑制因子的泛素化降解［10-13］；經典Aux/IAA蛋白直接通過蛋白結合來抑制生長素響應轉錄因子ARF（Auxin response factor）最終調控下游基因轉錄［5，12］。在不同發育過程中，該信號通路通過不同組合的Aux/IAA-ARF轉錄調控元件，實現生長素調控的差異性和復雜性［5，14-16］。TIR1/AFB介導的生長素轉錄調控機制被稱為經典生長素信號通路［14，17］。然而，植物生長素的復雜功能不能完全通過TIR1/AFB介導的經典信號通路來解釋，例如生長素的快速反應、細胞間的生長素響應以及亞細胞水平上的調控等［14，17-19］。近期研究逐步闡明生長素在不同調控水平上存在非經典信號傳遞機制，通過與經典信號轉導通路的相互配合，協同控制植物復雜的發育過程［14，17-19］。

1 TIR1/AFB介導的非經典生長素信號轉導通路

1.1 生長素調控細胞伸展的分子機制

生長素促進下胚軸細胞的細胞伸展（Cell expansion）是典型的生長素功能之一。前期研究發現生長素主要通過細胞質膜質子泵ATP酶（PM H+-ATPase）的激活和質外體（Apoplast）的酸化來促進植物細胞生長，也就是 “酸性生長假說”［20］。細胞生長的動力來自于細胞內液泡的膨壓，同時需要細胞壁結構軟化來為細胞生長提供空間。酸性生長調控機制的核心元件是定位在細胞膜上的質子泵蛋白H+-ATPase。生長素通過激活H+-ATPase降低細胞壁的PH值，通過調控細胞壁相關蛋白包括Expansin蛋白、XTH（Xyloglucan endotransglycosylase）蛋白以及PME（Pectin methylesterases）蛋白，增加細胞壁的擴展性能，從而促進細胞擴展［20］。生長素酸性生長假說的核心問題是生長素如何激活質膜定位蛋白H+-ATPase。研究發現擬南芥下胚軸細胞的酸性生長依賴于TIR1/AFB-Aux/IAA-ARF信號通路［21］。生長素通過TIR1/AFB信號通路局部激活H+-ATPase從而介導細胞壁的快速酸化和下胚軸的伸長，該結果為生長素酸性生長假說提供了直接的實驗證據［21］。除此之外，研究發現在擬南芥中，AHA2（Autoinhibited H+ATPase2）蛋白的碳末端存在關鍵的調控位點，其Thr947位點的磷酸化決定了其質子泵的活性［22］。生長素能在10 min內快速磷酸化AHA2蛋白的Thr947位點從而激活該蛋白，進而調控細胞壁的酸堿性從而調控細胞生長［22］。為了研究生長素快速磷酸化激活AHA2蛋白是否通過核內受體TIR1/AFB蛋白，研究人員根據TIR1受體的蛋白結構，通過工程學方法將TIR1蛋白改造為ccvTIR1（concave TIR1）蛋白，改造后的ccvTIR1只能特異性識別改造后的生長素cvxIAA（convex IAA）而不能識別未改造的IAA，從而規避生長素的其他復雜響應來特異性研究TIR1受體介導的信號通路［23］。有意思的是，改造后的生長素cvxIAA在ccvTIR1轉基因植物中依然能夠快速促進AHA2蛋白的磷酸化，這說明該細胞膜上的生長素快速反應依然部分依賴于細胞核TIR1/AFB受體［23］。然而到目前為止，TIR1/AFB受體直接參與該快速反應的分子機制仍不清楚。

生長素通過磷酸化修飾調控AHA的蛋白活性，意味著一定有激酶和磷酸酶參與到該調控過程。研究發現，磷酸酶家族蛋白D分支的PP2C.D蛋白能夠直接和AHA2蛋白互作并調控其Thr947位點的去磷酸化，從而影響植物細胞生長。生長素通過經典TIR1/AFB信號通路誘導SAUR（Small Auxin Up RNA）基因表達，SAUR蛋白的積累能夠競爭性結合PP2C.D磷酸酶蛋白來抑制該磷酸酶對AHA2的去磷酸化從而激活AHA2［24］。該機制部分揭示了生長素如何調控H+-ATPase的活性，然而到目前為止直接參與AHA2磷酸化修飾的蛋白激酶仍有待于進一步的尋找和探索（圖1）。

1.2 生長素快速抑制根生長的信號通路

圖1 擬南芥經典和非經典生長素信號通路示意圖

生長素對植物根器官生長的快速抑制是另一個典型的生長素響應過程，其分子機制仍不清楚。最近的研究利用微流控技術、垂直活體顯微成像技術和數學模擬等方法［25-27］，探索了生長素快速抑制植物根系伸長的分子機制［28］。當利用微流控技術對擬南芥根系施加生長素時，生長素對根的抑制反應非常迅速，發生在30 s以內；當去除生長素時，根系生長快速恢復，發生在2 min以內，幾乎沒有滯后期。如此快速的生長素反應似乎無法通過細胞核內生長素TIR1受體介導的經典轉錄調控機制來解釋，然而通過對tir/afb突變體進行分析以及對cvxIAA-ccvTIR1配對的生理效果進行檢測［23］發現TIR1/AFB受體對于生長素快速調控根系生長是必需的，證明生長素TIR1/AFB受體可能存在非轉錄調控的分子機制，這還有待于進一步發掘。

生長素快速抑制植物根系生長的另一個機制是通過細胞膜上鈣離子的瞬間跨膜流動，導致細胞內外的鈣離子濃度和PH的變化來實現的［29］。研究發現生長素處理和重力刺激通過環核苷酸門控通道蛋白 CNGC14（Cyclic Nucleotide-gated Channel） 引 起鈣離子的快速流入和膜外堿化，細胞壁堿化導致細胞伸長被抑制，因此在cngc14突變體中生長素引起的生長抑制和向地性彎曲生長都顯著延遲［30］。生長素10 s內引起的鈣離子流動顯然也難以用生長素經典轉錄調控機制來解釋。最近，Dindas等［31］發現根毛中生長素內運蛋白AUX1（Auxin resistant 1）對于根毛生長素攝取和膜去極性化是必須的；AUX1介導的生長素運輸以及生長素觸發的鈣信號能夠被TIR1/AFB抑制劑auxinole阻斷；此外，在tir1afb2afb3和cngc14突變體中，AUX1介導的生長素運輸以及生長素觸發的鈣信號變化也顯著降低。這說明AUX1轉運蛋白、TIR1/AFB受體與CNGC14鈣離子通道都參與調控根部生長素的快速響應過程。生長素能夠在數秒內誘導根毛質膜的鈣離子內流［31］，而且這種效應依賴于生長素內運蛋白AUX1以及TIR1/AFB受體，再一次證明TIR1/AFB受體可能存在轉錄調控之外的分子機制［32］（圖1）。

2 不依賴于TIR1/AFB的非經典生長素信號轉導通路

2.1 非經典ARF介導的生長素信號轉導通路

經典的生長素響應轉錄因子ARF家族蛋白通過其PB1結構域與Aux/IAA蛋白結合，從而被TIR1/AFB受體調控。然而ARF家族蛋白中存在非經典ARF（圖2-A），如擬南芥ARF3蛋白（又被稱為ETTIN蛋白），因缺失PB1結構域而不能與經典TIR1/AFB信號通路的元件相互作用，因此ETTIN的功能并不依賴于TIR1/AFB受體［17］。研究發現ETTIN蛋白的C末端是其功能調控的關鍵區域，具有絲氨酸富集的特點，因此可能被上游激酶調控［33］。同時ETTIN蛋白能和其他的轉錄調控因子包括 INDEHISCENT（IND）、REPLUMLESS（RPL）、BREVIPEDICELLUS（BP）蛋白互作，而生長素能夠抑制這些蛋白復合體的形成，從而調控基因轉錄［34-36］。有意思的是，最新的研究發現生長素能夠直接與ETTIN蛋白特異性結合，抑制ETTIN蛋白和TOPLESS蛋白與HDA9組蛋白乙酰轉移酶的互作，促進組蛋白乙酰化，調控基因轉錄的重編程，從而參與植物關鍵發育過程［37-38］。這也意味著生長素能夠直接通過非經典ARF調控基因轉錄。這其中還有許多疑問有待進一步解析，例如ETTIN蛋白是否是新的生長素受體；ETTIN蛋白介導的生長素非經典信號通路如何與經典的TIR1/AFB-AUX/IAA-ARF信號通路相互協調控制基因轉錄等（圖1）。

圖2 擬南芥ARF蛋白和IAA蛋白的系統進化樹分析

2.2 非經典Aux/IAA介導的生長素信號轉導通路

經典的轉錄抑制因子Aux/IAA蛋白存在4個結構區域，其中蛋白結構域II（DII）是Aux/IAA與TIR1/AFB 受體結合的關鍵區域［15，39］。生長素通過促進TIR1/AFB和Aux/IAA的蛋白互作，將經典Aux/IAA蛋白多聚泛素化，從而通過蛋白酶降解。除此之外，經典IAA也存在別的調控模式，其中包括光受體PhyB/CRY1通過競爭性抑制TIR1/AFB受體與Aux/IAA的互作來調控生長素響應；LRT2（Lateral rootless 2）通過調控Aux/IAA蛋白的順反異構來決定其與TIR1/AFB受體的互作；PTRE1（Proteasome Regulator 1）通過抑制蛋白酶體的活性來調控Aux/IAA的降解［40-42］，這些重要發現都充分證明了Aux/IAA蛋白調控的復雜性。Aux/IAA蛋白家族中也存在一類非經典Aux/IAA蛋白，因其蛋白缺失結構域II而可能不被TIR1/AFB受體識別，這其中包括擬南芥 IAA20、IAA30、IAA31、IAA32、IAA33 和 IAA34 蛋白［15，39］（圖 2-B）。由于非經典IAA蛋白無法被TIR1/AFB調控，因此其調控和作用機制有別于經典IAA蛋白。最近一系列研究發現非經典IAA蛋白的作用機制與經典IAA蛋白完全不同，生長素非但沒有通過TIR1/AFB降解非經典IAA蛋白，反而通過上游蛋白激酶磷酸化修飾穩定非經典IAA蛋白［43-44］。在子葉頂端彎鉤發育過程中，彎鉤內側生長素通過TMK激酶調控非經典IAA32和IAA34蛋白的穩定性，然后通過ARF轉錄因子調控基因表達來維持子葉彎鉤內外側的差異性生長［43］。在根尖分生組織，生長素通過MPK14調控非經典IAA33蛋白的穩定性，從而和經典IAA5蛋白競爭性結合下游ARF10和ARF16，調控基因轉錄來維持根尖分生組織的穩態［44］。上述研究闡明了非經典IAA蛋白不再被TIR1/AFB介導的泛素化蛋白降解途徑調控而是被上游相關激酶途徑調控；與此同時生長素不再降解非經典IAA蛋白反而促進其蛋白的穩定性；非經典IAA蛋白仍然通過ARF轉錄因子調控基因轉錄。對IAA蛋白的進化樹研究發現，非經典IAA在進化上也很保守，這意味著在植物自然選擇和進化過程中，非經典IAA的功能也是必須的。非經典IAA蛋白介導的生長素信號通路仍有許多未知的問題有待于解決，如非經典IAA蛋白既然不通過TIR1/AFB泛素化途徑降解，那其降解機制是什么；其他非經典IAA蛋白的功能和調控機制也有待于進一步解析（圖1）。

2.3 小G蛋白ROP GTPase介導的非經典生長素信號通路

植物ROP（Rho-related GTPase of Plant）蛋白信號途徑是生長素非經典信號通路的另外一個重要分支。ROP蛋白被認為植物信號轉導的分子開關之一，存在GTP結合的活性形式和GDP結合的非活性形式。當ROP蛋白被激活之后，可以開啟下游復雜的信號調控網絡，調控包括細胞骨架、極性運輸、基因轉錄等過程［45］。研究發現，生長素能夠快速激活ROP蛋白。在葉表皮細胞中，生長素激活ROP2蛋白調控微絲蛋白動態，激活ROP6調控微管蛋白動態，從而調控葉表皮細胞的極性建成和形態發生。在根毛發育過程中，生長素通過小G蛋白在生毛細胞中的極性定位決定了根毛產生的位置［46-47］。同時，對ROP活性的調控也影響根毛產生的位置和生長，如過表達ROP2會產生更多且更長的根毛［47］。最新研究發現，生長素能夠通過小G蛋白ROP2激活TOR（Target of Rapamycin）激酶，然后通過E2F轉錄因子，調控植物分生組織的細胞分裂活性［48］。然而，生長素激活小G蛋白非常迅速，在30 s就能激活小G蛋白ROP2和ROP6［49-51］，這種快速激活意味著生長素激活小G蛋白的機制不可能依賴于TIR1/AFB介導的轉錄調控，而存在新的調控機制。

研究發現生長素結合蛋白ABP1（Auxin binding protein 1）以及類受體激酶家族蛋白TMK（Transmembrane Kinases）介導生長素對小G蛋白的快速激活［49-50］。ABP1蛋白因早期T-DNA突變體遺傳材料的問題，其功能有待于進一步解析［52-54］。近期研究發現，生長素能夠促進小G蛋白ROP6在細胞膜上與膜磷脂結合形成微聚體來激活ROP6信號通路［55］，而這個過程也依賴于 TMK1 和 TMK4［56］。這些研究說明，生長素調控小G蛋白是發生在細胞膜上的分子水平反應，其原理的進一步解析有助于理解生長素快速反應的產生機制（圖1）。

2.4 TMK家族蛋白介導的生長素信號轉導機制

類受體激酶通常是傳遞信號的關鍵元件，在植物激素信號轉導中具有極其重要的作用，如類受體激酶BRI1（Brassinosteroid insensitive 1）作為油菜素內酯受體介導其信號轉導過程［57］。最近研究發現類受體激酶家族TMK蛋白（Transmembrane Kinase）在生長素信號轉導中發揮著至關重要的作用，從非轉錄水平調控植物細胞的生長素響應［43，58-59］。除了生長素激活小G蛋白信號通路依賴于TMK家族激酶，在側根發育過程中，局部有序的生長素分布通過TMK1和TMK4調控器官發生過程中細胞分裂模式的有序性，從而精準調控側根的有序發生［58］。研究發現生長素通過TMK1/4磷酸化激活絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase）MKK4/5-MPK3/6信號途徑，來調控細胞分裂模式，也是生長素信號和MPK信號途徑直接關聯的重要證據［58］。最新研究發現，生長素能夠通過TMK4蛋白磷酸化修飾生長素合成關鍵酶TAA1（TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS），負調控生長素的生物合成［59］。這也是首次報道生長素合成的翻譯后調控機制，說明植物體內生長素濃度存在快速的自我調控機制，以滿足植物生長發育的需求［59］。

有意思的是，TMK家族蛋白不僅參與生長素的非轉錄水平調控，也參與轉錄水平的調控。研究發現高濃度生長素能夠激活一條全新的抑制植物局部生長的信號通路。在子葉頂端彎鉤內側聚集的高濃度生長素能夠促進TMK1蛋白的剪切，通過剪切下來的TMK1蛋白的C末端肽段將生長素信號傳遞到細胞質和細胞核調控下游反應。TMK1蛋白C端特異性識別并磷酸化穩定非經典IAA蛋白IAA32/34，IAA32/34蛋白的積累通過結合ARF轉錄因子來抑制基因轉錄，最終導致在子葉頂端彎鉤內側細胞伸長被抑制來維持內外側差異性生長［43］。說明生長素TIR1/AFB和TMK1介導的生長素信號途徑精準分工，分別選擇經典和非經典的IAA蛋白進行差異化調控下游反應。

擬南芥中TMK家族蛋白有4個成員，不同的TMK蛋白在植物生長發育的不同階段表達，從而行使不同的功能。擬南芥tmk1；tmk2；tmk3；tmk4四突變體表現極其嚴重的發育缺陷，最終導致不育的表型，說明TMK家族蛋白功能的復雜性和多樣性［60］。研究已經表明，TMK激酶介導的生長素信號轉導通路在不同植物組織、不同亞細胞位置（從細胞膜到細胞核）、不同水平上（從非轉錄水平到轉錄水平）全方位調控植物生長發育。然而，TMK家族介導的生長素信號轉導機制仍有許多未解決的問題，例如生長素信號是如何被TMK類受體激酶感知？TMK的作用是否需要其結合蛋白ABP1？TMK家族蛋白剪切介導的信號傳遞機制是否普遍存在及調控機制是什么？這些問題都有待于進一步解析。

3 展望:非經典生長素信號途徑的研究瓶頸和前景

本綜述初步概括了生長素非經典信號傳遞通路的研究進展。生長素調控植物生長發育極其復雜和多樣。這些研究進展一方面拓展了對生長素調控網絡的深入認識，另一方面也提出了新的問題和挑戰。

3.1 非經典信號通路中生長素的感受機制

隨著非經典信號通路的逐步解析，生長素是如何被感知的依舊是核心問題之一。其中包括:（1）生長素TIR1/AFB受體是否存在其他不依賴于Aux/IAA蛋白的作用機制。（2）TMK家族激酶是否能夠像BRI1一樣直接感知生長素，是否需要類似ABP1的輔助蛋白。（3）生長素結合蛋白ABP1是否參與非經典生長素信號通路；abp1單突變體表型不明顯，這和ABP1生化和細胞水平功能相矛盾，如何去解析；ABP1作為沒有功能域的結構蛋白，是否存在相似結構蛋白的功能冗余或功能補償效應。（4）是否存在別的生長素結合蛋白，如何去尋找和鑒定。

3.2 生長素經典與非經典信號通路的協同調控

生長素作為小分子化合物在植物細胞內聚集后，同時啟動經典和非經典信號通路來調節植物的生長發育，必然存在精準的協同機制。例如，多信號通路之間在時間和空間上是如何協同的，如何解析正反饋調控與負反饋調控的復雜效應；多信號通路在不同組織器官對不同濃度生長素如何協同產生不同的發育效應的；多信號通路如何協同參與植物對復雜環境的響應的。這些問題的解答，將有助于全面解析生長素信號調控網絡，為精準調控生長素響應奠定理論基礎。