番茄抗黃葉卷曲病相關基因Ty-6的克隆、序列分析及表達特性

朱曉林 魏小紅 王寶強 王賢 張朝陽

（1. 甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；2. 甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室，蘭州 730070；3. 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，蘭州 730070）

番茄（Solanum lycopersicuml）是一種重要的果蔬，是植物中的作物。目前番茄生產中最主要的問題是病害問題，尤其是病毒病，而雙生病毒科的雙生病毒引起了世界主要蔬菜作物的重大經濟病害，其中番茄黃葉卷曲病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是引起番茄嚴重病害的重要因素［1］。這種病毒通過昆蟲載體-煙粉虱傳播，在地中海東部、非洲北部和中部以及東南亞的夏季和秋季感染番茄品種。作為第一個報道的由煙粉虱傳播的病毒，其具有單一的基因組分子，基因組由2 787個核苷酸組成，編碼6個開放閱讀框［2-3］。作為一種至少由兩種病毒［4-5］番茄黃葉卷曲撒丁島病毒和番茄黃葉卷曲病毒引起的病害，其病毒成員之間的遺傳重組產生了一系列新雜交基因組［6］，因此該病毒已成為當今世界急需解決的一大難題。

目前番茄的育種策略主要集中在從相關野生種質中導入抗性等位基因，并在遺傳上具有一定的特征。研究較多的基因有Ty-1、Ty-2以及Ty-3。Ty-1是從辣椒品種LA1969中導入的，定位于番茄第6號染色體［7］。從辣椒種質LA1932/LA2779/LA1938中導入了另一個TYLCV抗性基因Ty-3，并定位于第6染色體［8］。后來，Ty-1和Ty-3被確定為等位基因，并編碼一種RNA依賴的RNA聚合酶，該聚合酶通過增加病毒基因組中的胞嘧啶甲基化而產生耐藥性。發現的第二個TYLCV抗性基因為Ty-2基因，該基因位于11號染色體上［9］，確定Ty-2是一個核苷酸結合結構域和富含亮氨酸重復序列（NB-LRR）基因［10-11］。隨后從辣椒品種LA1932中鑒定到另一個TYLCV抗性基因Ty-4，并定位于第3染色體。與其他Ty基因相比，Ty-4對TYLCV的作用較弱［12］。Ty-5編碼一個信使RNA監視因子Pelota，它參與了蛋白質合成的核糖體循環階段［13］，其被定位于4號染色體上，屬于隱性抗病基因［14-15］，目前國內外對Ty-1到Ty-5的研究比較透徹，然而對于抗病基因Ty-6的研究鮮有報道。

因此，在本研究中我們通過克隆Ty-6基因，利用生物信息學手段對其編碼蛋白的氨基酸序列進行分析，采用熒光定量PCR技術研究番茄植株感染TYLCV后Ty-6基因在不同時期不同組織中的表達特性，從而初步了解該基因的抗病功能特性，為今后進一步研究Ty-6的功能以及在植物遭受病害后該基因的表達模式提供一定的參考信息，同時也為番茄抗病育種提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用番茄種植于甘肅農業大學生科院試驗基地，在光照培養箱（12 h光照/12 h黑暗，25±1℃）中培養，取材源于自育番茄的葉片與莖，將長勢均勻一致的番茄幼苗接種TYLCV后0、5、15、30 d分別采取番茄葉片與莖，液氮冷凍后，-80℃保存備用，每個處理最少3次重復，用于后續試驗。

1.2 方法

1.2.1 番茄RNA提取以及cDNA的合成 采用天根試劑盒（RNAsimple Total RNA Kit）進行操作提取番茄染病后0、20、30及40 d的莖和葉的總RNA，并通過超微量紫外分光光度計（Q5000）檢測其濃度與純度，以便后續反轉錄合成cDNA順利進行，其反轉錄體系參考天根試劑盒（FastKing RT Kit）。

1.2.2Ty-6基因克隆 在NCBI中下載Ty-6基因CDS序列，利用Primer Premier 5軟件設計用來擴增Ty-6基因CDS序列的引物，以番茄未染病前的cDNA 為模板，反應體系為:上下游引物各1 μL（10 μmol/L）、模板 cDNA 1 μL、高保真酶 7 μL 以及無菌水10 μL，進行PCR擴增以及在1%瓊脂糖凝膠中進行PCR產物的電泳。克隆步驟如下:（1）PCR產物切膠回收:將PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外燈下觀察并切下預期大小的DNA片段，采用天根公司的Universal DNA Purification Kit膠回收試劑盒進行純化，純化產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測純度，并測量溶液DNA濃度。（2）目的片段與載體連接:膠回收產物與T載體連接，參照TaKaRa公司pMD18-T載體的試劑盒說明書。（3）連接產物轉化E.coilDH5α:①將5 μL連接產物加入到100 μLE.coilDH5α感受態細胞中，輕輕旋轉離心管混勻內容物，冰上靜止1 h；②42℃水浴熱激轉化90 s，立即放回冰上，放置3 min；③每管加入500 μL LB培養基，37℃，180 r/min震蕩培養1 h，使菌體復蘇并表達抗性基因；④在含有Amp（100 μg/mL）的選擇性平板上加80 μL菌液，用無菌涂布棒輕輕涂布均勻后，用Parafilm膜封好；⑤倒置培養皿培養15 h。（4）轉化子的篩選及鑒定:挑選單菌落在含Amp的液體培養基中，37℃，180 r/min震蕩培養12 h后，以菌液為模板進行PCR鑒定，鑒定的陽性菌液送天啟公司進行測序，測序正確序列用于后期生信分析。

表1 所用引物信息

1.2.3Ty-6基因編碼蛋白基本結構分析 利用NCBI-ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在線軟件查找Ty-6基因的閱讀框，通 過 ExPASy-ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件預測該蛋白的一級結構；ExPASy-ProtScale（https://web.expasy.org/cgibin/protscale/protscale.pl）分析該蛋白的親水性、松散性、蛋白相對突變型以及極性等基本理化性質［16］；二級結構的預測［17］通過法國里昂 CNRS的SOPMA 軟 件（https://blog.csdn.net/wangliang_f/article/details/22859187）；信號肽以及二硫鍵分別通過SignalP4.1serve（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和 Scratch Predict Protein 在線軟件預測［18］；其蛋白的跨膜結構域借助TMHMM Server v. 2.0平臺（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析，利用在線軟件PSORTb version3.0.2（https://www.psort.org/psortb/index.html）進行亞細胞的定位［19］；磷酸化位點與糖基化位點在使用NetPhos 3. 1 平臺（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK） 以 及NetOGlyc 4. 0在線軟件分析。

1.2.4 q-PCR驗證 通過Primer Premier5進行熒光定量PCR引物的設計，以番茄Actin為內參基因，以獲得的cDNA為模板進行PCR擴增，每個時期樣本均為3次重復，qT-PCR總體系（20 μL）:模板cDNA 為 3 μL、EvaGreen2×qPCR Master Mix為 10 μL、引物 1 為 0.5 μL（10 μmol/L）、引物 2 為 0.5 μL（10 μmol/L）以及ddH2O為6 μL。其擴增步驟:95℃預變性6 min，95℃變性10 s，60℃復性 30 s，進行40個循環。

1.2.5 啟動子分析 通過Gramene datebase（http://www.gramene.org/）下載并截取Ty-6基因轉錄起點上游1 kb區域，通過PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線軟件進行順式作用原件的預測分析［20］。

1.2.6 三級結構及系統發育樹分析 通過NCBI的在線軟件CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析該蛋白功能結構域，三級結構采用SWISSMODEL平臺（https://swissmodel.expasy.org/interactive/NJSqC4/models/）分析預測，應用MEGAX軟件里的Clustal W程序對鑒定的核苷酸序列進行多重序列比對，比對結果采取鄰近法用于系統發育樹的構建，使用Poisson模式，重復次數為1 000，其他參數默認［21］。

2 結果

2.1 Ty-6基因克隆

對挑選出的陽性單克隆進行菌液PCR鑒定，在1%的瓊脂糖進行凝膠電泳，其電泳結果如圖1所示，除3、5及6號點樣孔外，其余各孔均擴增出包含CDS區（92-1 009 bp）的全長為1 079 bp的目的條帶，與預期結果一致。對其目的片段進行膠回收純化并序列測序，用于后續序列分析及構建系統發育樹。

圖1 Ty-6基因克隆片段

2.2 Ty-6編碼蛋白結構分析

結果表明Ty-6基因全長1 286 bp，共含9個開放閱讀框，其中編碼區只有1個，且編碼區長度為918 bp（92 bp-1 009 bp）共編碼 305 個氨基酸（圖 2）。對Ty-6基因編碼蛋白進行預測表明，該編碼蛋白分子量為33 446.85，化學式為C1442H2363N433O460S10，其理論等電點為9.74，屬于堿性蛋白，帶負電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）37個，正電荷氨基酸殘基數53個，不穩定指數達56.64，親水性平均值為-0.737。同時蛋白的相對突變預測表明該蛋白高突變區在93-115位氨基酸間，其高極性區在168-172位氨基酸間，高松散區在100 -113位氨基酸間。

圖2 Ty-6基因cDNA全長及編碼區翻譯的氨基酸序列

二級結構預測（圖3）表明該蛋白只含α-螺旋、無規則卷曲以及延伸鏈三種結構元件，其中無規則卷曲最多，共202個氨基酸，占比為66.32%，其次是延伸鏈，占比17.05%，最后為α-螺旋，占比17.05%，按照Skolnick等報道的二級結構分型，該蛋白二級結構屬于混合型；SignalP4.1預測結果顯示該蛋白不存在信號肽，TMHMM平臺以及二硫鍵預測顯示該蛋白不含跨膜結構域，而在存在的5個Cys中，預計形成2個二硫鍵，其位置分別在氨基酸24-57以及162-172位間，對Ty-6基因的表達產物進行亞細胞定位預測得其蛋白主要分布在細胞質膜上。

圖3 Ty-6基因編碼蛋白二級結構

蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制。蛋白質磷酸化主要發生在兩種氨基酸上，一種是絲氨酸（包括蘇氨酸）；另一種是酪氨酸。這兩類酸磷酸化的酶不一樣，功能也不一樣，但也有少數雙功能的酶可以同時作用于這兩類氨基酸，如MEK（促絲裂原活化蛋白激酶Mitogen-activated proteinkinase kinase，MAPKK）。絲氨酸磷酸化的主要作用是變構蛋白質以激活蛋白質的活力，主要是指酶活力。而酪氨酸磷酸化除了能激活該蛋白活力之外，更重要的功能是給結合蛋白提供一個結構基因，以促進其和其他蛋白質相互作用而形成多蛋白復合體。蛋白復合體的形成再進一步促進蛋白質的磷酸化。周而復始，由最初蛋白質磷酸化所產生的信號就依次如此轉下去。如果最初產生的是一個刺激細胞生長的信號，此信號將最終轉入細胞核，導致DNA復制和細胞分裂。該基因編碼蛋白磷酸化表明該編碼蛋白共含有51個磷酸化位點，分別位于絲氨酸與蘇氨酸殘基上，其中38個絲氨酸磷酸化位點，13個蘇氨酸磷酸化位點；因此多個絲氨酸磷酸化位點在激活蛋白活力方面有重要作用。其糖基化預測顯示該蛋白具39個糖基化位點。

圖4 磷酸化位點預測結果

2.2.4 啟動子序列分析 為進一步研究Ty-6基因的結構與功能，選取Ty-6基因上游2 000 bp進行啟動子分析，同時通過在線數據庫PlantCARE進行順勢作用元件預測，該基因的啟動子序列除具有真核生物特有的TATA-box與CAAT-box等核心啟動子元件外，還具有許多響應元件，如茉莉酸、水楊酸以及脫落酸等植物激素響應元件，也含一些玉米醇溶蛋白代謝調節、干旱誘導及厭氧誘導相關的作用元件（表 2）。

表2 Ty-6啟動子元件

2.2.5 功能結構域、三級結構及系統發育樹分析 該編碼蛋白不含任何超家族結構域，將Ty-6基因編碼的氨基酸序列在SWISS-MODEL軟件上以3lpf.1.D為模板進行同源建模，結果如圖5所示，其三級結構模型相對復雜，其主要結構由無規卷曲構成，與二級結構預測一致。利用MEGAX軟件對番茄、馬鈴薯、煙草及葡萄的蛋白進行同源序列比對分析，構建系統發育進化樹。結果（圖6）顯示，番茄、馬鈴薯、辣椒以及煙草同在一個分支中，且馬鈴薯與番茄的親緣關系最近，其同源性高達100%，辣椒與煙草和番茄的親緣關系次之。

2.2.6Ty-6基因在感染TYLCV后的表達特征 由下圖可知，在番茄感染黃葉卷曲病前后Ty-6基因在莖與葉中均有表達，隨著染病時間的增加，其在莖與葉中的總體表達趨勢表現為先增后減，同時莖中Ty-6基因在染病后30 d時表達量達到最大且顯著（P＜0.01）區別于其他3個時期；葉中Ty-6基因在各個時期的表達量均存在顯著差異（P＜0.01），其表達量同樣在染病后30 d達到最大值，然而番茄表型在感染黃葉卷曲病前后并無明顯的特征變化。

圖5 三級結構預測

3 討論

番茄作為世界上廣泛種植的蔬菜水果作物，具有極高的營養價值，然而目前番茄生產上最突出的問題就是病蟲危害，尤其是TYLCV，其嚴重影響了番茄產量與品質。因此培育具有TYLCV抗性的新品種是當前世界番茄育種的重要目標之一，且許多顯性和隱性抗病基因已被很好地鑒定和應用于各種作物的育種。研究表明Ty-1與Ty-3作為抵御TYLCV的主要抗性基因，其抗性是基于其基因組的胞嘧啶甲基化水平增加［22-23］，且兩基因疊加可增強其抗病性；同時 Ji等［24］和Verlaan等［25］確定了第3染色體上的Ty-4抗性位點，對單獨或與ty-4聯合攜帶ty-3的育種材料進行抗多個二分體病毒的篩選表明，兩個基因組合的抗性更強。但是，尚不清楚在育種材料中是否存在除ty-4以外的其他雙抗性位點。目前，Scott等［26］在育種材料 Fla. 8638B、Fla. 8624 和Fla. 8680中發現了新的抗性位點并指定為Ty-6，并一直努力在番茄中繪制該位點圖，將Ty-6定位到10號染色體的末端，且該位點已被證明對TYLCV與二分葉番茄斑駁病毒均有抑制作用，且其抗性是針對雙生病毒，而非病毒載體［27］，而對于Ty-6基因與其他抗性基因互作的抗病功能還需進一步研究。

圖6 系統發育進化樹結果

圖7 不同時期莖與葉中Ty-6基因的表達分析

本研究克隆了番茄Ty-6基因，生物信息學分析表明其亞細胞定位于細胞質膜上，而Ty-6作為抗病基因，其編碼蛋白可能是一種表面抗原蛋白，能夠和特異的抗體結合，從而抵制TYLCV；啟動子作為關鍵的調控基因表達的DNA序列，在轉錄起始時發揮著重要作用，同時啟動子的多少直接影響下游基因轉錄的效率，而TATA-box作為關鍵的順式作用元件，決定著轉錄起始位點及其起始頻率，是大多數真核基因正確表達所必需的［28］，該基因啟動子區具有63個TATA-box，且含多個光響應、茉莉酸、水楊酸以及脫落酸等誘導Ty-6基因表達的元件［29-30］，因此該基因存在強啟動子區域；系統發育樹結果顯示其與馬鈴薯的親緣關系最近，說明番茄與馬鈴薯的Ty-6基因可能源于共同的祖先基因，也可能因進化程度不同，其在各物種中的表達模式不同；Ty-6作為抗病基因，已被證明對二分葉番茄斑駁病毒具明顯的抗性［31］，而在抵御TYLCV中的作用還有待進一步探究。而q-PCR結果顯示番茄感染黃葉卷曲病毒后葉片中Ty-6的表達發生明顯變化，說明該基因在抗病防御過程中發揮著關鍵的作用，而該基因在感染黃葉卷曲病后其在葉中的表達量明顯高于莖中，可能該基因具有組織表達特異性，同時接種病毒前后感病癥狀基本無明顯變化，這可能是該基因起主要作用，也可能是該基因與其它抗性基因相互作用從而抵御外界干擾，其與其它基因并無上位效應，而該基因在抵御病毒過程中與其它抗病基因相互獨立作用的研究已有報道［32］，因此今后將多個抗病基因導入到同一番茄品種是個不錯的切入點。

4 結論

通過克隆得到番茄Ty-6基因，利用生物信息對該基因編碼產物進行一級、二級、三級結構以及基本理化性質的分析，同時通過q-PCR技術研究Ty-6基因在番茄染病后不同時期的表達量。結果表明:Ty-6基因開放閱讀框918 bp，共編碼305個氨基酸，屬于一種堿性蛋白；其二級結構以無規則卷曲為主，預測蛋白定位于細胞質膜上；且含有51個磷酸化位點與39個糖基化位點；啟動子區主要以TATA-box為主，且含有多個誘導基因表達的元件；三級結構相對簡單，其系統發育樹得番茄與馬鈴薯的親緣關系最近；q-PCR顯示該基因在感染病毒后葉中的表達量明顯高于對照，且具組織表達特異性，同時表型鑒定結果也顯示在Ty-6基因表達高時其感病效果不明顯，因此該基因研究不僅擴展了育種者可用的Ty基因工具包，也提供了一種抗病的可行思路。