高通量篩選地衣芽孢桿菌DW2高產桿菌肽誘變菌株

米粱波 曾偉主 黃科學 王得明 堵國成 周景文 陳堅

（1. 江南大學生物工程學院，無錫 214122；2. 齊魯制藥（內蒙古）有限公司，呼和浩特 010080）

桿菌肽是一種由枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌產生的多肽類廣譜抗生素，由多種環狀同系物組成，包括桿菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3和F，其中桿菌肽A和B占有95%抗菌活性［1］。桿菌肽A易轉變成無抗菌活性的桿菌肽F，且桿菌肽F具有腎毒性［2］。在實際生產過程中，為避免桿菌肽A的降解，通常在發酵終點添加Zn2+等二價金屬離子，將桿菌肽轉變成抗菌活性更強和更穩定的“金屬-肽”螯合物［3］。桿菌肽對革蘭氏陽性和部分革蘭氏陰性細菌都具有強的抑菌活性，且對人和動物都沒有致病性，因而廣泛應用在臨床醫學和作為常用的動物飼料添加劑［4］。

桿菌肽的生產是一個復雜的生物轉化過程，一般利用基因工程技術，通過理性改造提高桿菌肽產量的做法比較困難。目前工業上提高桿菌肽生產的方法主要集中在發酵優化和誘變選育。例如，采用正交試驗和Box-Behnken響應面法對桿菌肽發酵培養基中主要原料豆粕粉或麩皮的添加量進行優化［5-6］。在此基礎上，通過控制變量的方式優化桿菌肽發酵的溫度、溶氧和pH以獲得最佳發酵條件［7-8］。而應用傳統誘變選育的方式，篩選到桿菌肽產量比對照提高的突變菌株，為桿菌肽的工業生產奠定了基礎［9］。然而，隨著桿菌肽生產工業化進度的深入，使利用發酵優化和傳統誘變選育提高桿菌肽產量的選擇更加受限。另外，自2004年地衣芽孢桿菌的全基因組測序完成以后，基因工程技術逐漸被應用在桿菌肽生產的研究中［10］。根據提高桿菌肽合成前體氨基酸的胞內含量來促進桿菌肽合成的思路，過表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因zwf，通過提高NADPH/NADH比例來保證桿菌肽前體氨基酸的胞內供給，繼而實現桿菌肽效價的提高［11］。同樣，通過失活或過表達支鏈氨基酸胞內外轉運蛋白基因yhdD和brnQ，也實現了對桿菌肽合成的改善［12-13］。但遺憾的是，基因工程菌可能涉及到生物安全問題，并且簡單的分子操作對工業生產菌株的育種效果往往并不明顯［14］。從微生物育種技術的發展史來看，傳統誘變選育由于篩選通量低和人工負擔重的限制，影響了其在選育優良菌株方面的應用。隨著高通量篩選（High-throughput screening，HTS）技術的興起與發展，其作為傳統誘變選育技術的升級，實現了誘變選育工作的自動化、規模化和小型化。總之，HTS技術解決了傳統誘變選育“篩”的問題，并在大規模篩選和不需要了解產物合成遺傳背景的優勢下，用來提高桿菌肽這種次級代謝產物的產量，勢必將具有更加廣闊的前景。

在本研究中，采用常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）對細胞進行誘變，并借助流式細胞儀（Flow cytometer，FCM）分選出誘變后的活細胞至96孔板中培養。根據桿菌肽分子中酰胺鍵能與銅離子在堿性環境下反應的化學性質，建立了雙縮脲反應結合三氯醋酸（Trichloroacetic acid，TCA）沉淀的高通量初篩方法。利用酶標儀檢測反應顏色，快速鎖定陽性突變，極大的提高了篩選的通量和縮短了育種的周期。總之，本研究提供了一種提高桿菌肽產量的新方法，并可以應用于其他多肽產品的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisDW2，DW2菌株），由齊魯制藥（內蒙古）有限公司提供。

1.1.2 主要儀器 FACSAriaTMⅢ流式細胞儀，美國BD公司；ARTP 儀，無錫源清天木生物科技有限公司；Cytation3 酶標儀，美國 BioTek 公司；安捷倫 1260高效液相色譜，美國 Agilent 公司。

1.1.3 培養基 液體培養基（g/L）:酵母浸膏20、氯化鈉5、硫酸鎂0.5；固體培養基（斜面）:在液體培養基中加2%的瓊脂粉；發酵培養基（g/L）:豆粕粉60、玉米淀粉40、花生餅粉5、玉米干漿2、玉米漿2、碳酸鈣4、硫酸銨1和高溫淀粉酶0.1。上述培養基全部用2 mol/L氫氧化鈉調pH值至7.5，并在121℃條件下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 ARTP誘變 挑取地衣芽孢桿菌平板單孢子至液體培養基中，37℃、220 r/min培養至OD600=1.2-1.4。取1 mL菌液離心收集細胞，用5%的甘油作為保濕劑的生理鹽水洗滌3次，并取1 mL上述溶液重懸。取10 μL細胞溶液均勻涂抹至無菌載片表面，在放電功率100 W和氮氣流量10 SL/min的條件下，分別處理 0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、80 s、100 s和120 s。然后，將載片轉移至裝有PBS緩沖液1 mL的EP管中，充分振蕩洗脫。將洗脫的菌液適當稀釋，并取100 μL涂布至固體平板培養基上，37℃恒溫培養24 h計數。

1.2.2 高通量初篩流程 利用FCM將單細胞分選至裝有200 μL液體培養基的96孔板中，37℃、750 r/min培養20 h。取100 μL培養好的種子液轉接至裝有1 mL發酵培養基的48深孔板中，37℃、220 r/min發酵培養54 h。發酵結束后，加入15%的TCA溶液1 mL，在220 r/min條件下振蕩2 min充分混勻，在室溫靜置30 min使沉淀充分。然后，將深孔板在4℃、4 500 r/min條件下離心15 min，取發酵上清液80 μL至新的96孔板中，并與120 μL雙縮脲試劑反應5-10 min。最后，利用酶標儀在548 nm波長下檢測吸光值，根據吸光值大小判斷出高產的突變菌株。

1.2.3 搖瓶復篩 將初篩得到的突變菌株，取其96孔板保藏的種子液均勻涂布在固體斜面表面，37℃恒溫培養27 h。菌體斜面用3.5 mL無菌水充分洗脫并使細胞均勻分散，取1 mL菌液接種至裝有20 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中，37℃、220 r/min發酵培養48 h，高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）檢測發酵液中桿菌肽效價。

1.2.4 死細胞染色條件優化 挑取平板活化的單孢子至液體培養基中，37℃、220 r/min培養至OD600=1.2-1.4。利用PBS洗滌和重懸細胞，并將細胞溶液沸水浴20 min。取100 μL沸水處理的細胞溶液 分 別 和 0 μL、10 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL和100 μL體積的 50 μg/mL的PI儲存溶液（PBS配制）混合均勻，然后再用PBS定容至200 μL后放置冰里避光，分別反應0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min。染色結束后，立即取出染色的細胞溶液并用PBS定容至1 mL使染色停止。利用FCM分析染色結果，陽性信號比例越高則染色效果越好，信號比例由軟件自動計算顯示。

1.2.5 FCM分選方案 為更好的進行單細胞分選，分選前合適的圈門邏輯是實現好的分選效果的保證。首先，創建收集熒光信號的散點圖FCS-A/PerCPCy5-5-A，坐標為信號對數值。利用不經過染色的空白對照設置電壓，使細胞的本底熒光信號集中在101以內。其次，保持電壓不變，將陽性對照樣品上樣分析。創建PerCP-Cy5-5-A直方圖和FSC-A/SSC-A散點圖，在FSC-A/SSC-A散點圖中設門圈中信號，并調整門的位置和大小。當觀察到PerCP-Cy5-5-A直方圖為類似標準的正態分布形狀時，此時圈中信號的門最佳。在分選之前應先創建FSC-A/FSC-H 和SSC-A/SSC-H散點圖，去除目標細胞群中的粘連細胞信號。

1.2.6 雙縮脲試劑制備 根據文獻［15］配制雙縮脲試劑。

1.2.7 分析方法 發酵液中的桿菌肽效價用HPLC檢測，檢測方法與文獻［1］報道的一致。發酵樣品先與40 g/L的EDTA溶液等體積混合，在4℃條件下反應2 h，桿菌肽的總效價通過計算桿菌肽A和桿菌肽B的總峰面積得到。

2 結果

2.1 ARTP致死曲線繪制

由放電產生的等離子體，可在室溫下導致細胞膜通透性增加，進而損傷DNA。細胞致死曲線表明（圖1），ARTP處理15 s時，細胞的致死率為26%。處理時間為15 s-100 s時，細胞致死率增加緩慢，而當處理時間超過100 s，不超過120 s時，細胞的致死率增加明顯。這種增長可能與亞致死效應的增強有關，而此時有利于造成DNA的損傷。因此，選取100 s、110 s和120 s三個時間點來構建突變細胞文庫，與之對應的細胞致死率在70%-80%左右。

圖1 ARTP誘變致死曲線

2.2 HTS方法的建立

本研究取120 μL桿菌肽標準溶液與80 μL雙縮脲試劑混勻顯色，光譜掃描顯示雙縮脲反應顏色在548 nm處出現光吸收峰值（圖2-A）。配制桿菌肽標準品梯度溶液，與雙縮脲試劑充分反應后在548 nm處檢測吸光值（圖2-B）。結果表明，在桿菌肽濃度和吸光值之間有很好的相關性（R2=0.995 89）。為排除發酵液中雜蛋白對顯色的干擾，本研究選擇TCA作為沉淀劑。取1mL 15%的TCA溶液與深孔板發酵液振蕩混勻并充分沉淀。取80 μL沉淀處理后的發酵上清液，與120 μL雙縮脲試劑充分混勻反應，在548 nm處檢測吸光值。隨機取深孔板發酵液并用HPLC檢測桿菌肽效價，驗證深孔板中桿菌肽效價與吸光值之間相關性（圖3）。結果表明，HPLC檢測的桿菌肽效價與多孔板檢測的吸光值之間有較好相關性（R2=0.945 28）。因此，可選擇用15%的TCA溶液1mL沉淀深孔板發酵液，再用沉淀處理后的發酵上清液80 μL與120 μL雙縮脲試劑反應作為高通量初篩方法。

圖2 雙縮脲反應的光譜掃面和標準曲線

圖3 多孔板檢測和HPLC檢測的相關性

2.3 PI染色和FCM分選

優化PI染色死細胞條件的結果如表1所示。隨著PI溶液體積的增加和避光染色時間的延長，陽性信號的比例逐漸增加。而當PI儲液體積大于40 μL且染色的時間超過20 min時，陽性信號的比例不再增加或明顯增加。另外，為避免PI染色誘變后的活細胞，將PI染色死細胞的條件確定為100 μL細胞溶液與40 μL的PI溶液在200 μL的體系中置冰上避光染色20 min。最后通過優化的染色條件和設置合理的圈門方案，將細胞分選至96孔板中，可在固體培養基上觀察到生長出單菌落（圖4）。經過實踐檢驗，此分選方案可使細胞的回收率平均達95%以上。

表1 PI染色死細胞條件優化

圖4 在96孔板中生長的細胞

2.4 HTS桿菌肽高產菌株

在本研究中，將20塊96孔板的1 920株突變菌株，通過高通量初篩選出14株菌用于搖瓶復篩，搖瓶中檢測到最高桿菌肽效價的菌株直接用于下一輪誘變篩選。此外，用HPLC檢測篩選出的14株菌其深孔板發酵液效價，并以誘變次數為橫坐標作圖（圖5）。當誘變至第11代時，篩選到了深孔板發酵桿菌肽效價最高的突變菌株。當誘變至第6代時，篩選到第一株能夠穩定遺傳的桿菌肽高產菌株1#7E（圖6-A和6-B），相對出發菌株提高10.8%。然后繼續在高產菌株1#7E的基礎上誘變至第8代獲得8#6D和7#5E，相對出發菌株都提高20.9%。最后在誘變至11代時，獲得高產菌株6#7E、5#8D和2#5F，分別相對出發菌株提高20.8%、19.7% 和22.2%，并通過遺傳穩定性驗證，最終確定為高產桿菌肽菌株，桿菌肽最高效價為912 U/mL（圖6-C和6-D）。繼續誘變至第15代，但未能篩選到桿菌肽產量進一步提高的突變菌株。

圖5 高通量初篩

圖6 搖瓶復篩

3 討論

通常情況下，優良菌株的獲得主要依靠兩種策略:一是通過隨機誘變結合定向篩選獲取有用突變菌株；二是基于對目標產物代謝過程的理解，通過代謝工程和基因工程改造獲得有用工程菌株。前者隨著篩選策略和方法的發展而得到加強，后者則隨著組學技術和基因工程工具的發展而得到加強。微生物學的發展使第二種方法的應用取得了巨大的成功，但對于多數工業菌株的改良而言，由于它們本身已優于利用第二種方法改造的菌株，所以仍然以第一種方法作為主要手段。

HTS技術對于利用第一種方法進行微生物育種變得越來越重要，特別是高通量培養（High-throughput cultivation）技術，解決了細胞在微型容器生長和發酵過程中關于溶氧和染菌等問題。本研究利用96孔板生長培養和48深孔板發酵培養，可以保障細胞的正常生長與發酵，為HTS技術的應用提供了可能。與此同時，HTS技術不僅僅以生產力作為篩選的唯一結果導向，培養的規模化為在篩選過程中考察細胞形態、生長周期和發酵過程的顏色甚至氣味變化提供了途徑，有利于擴展我們對微生物細胞的認知。除此之外，規模化的特點使利用HTS技術選育環境中有用微生物同樣具有優勢。FCM自20世紀問世以來就作為研究細胞的工具而得到廣泛的應用，現如今FCM已發展成HTS育種的一部分［16］。本研究在FCM的幫助下，以每150 s分選96個單細胞至96孔板的速度分選，極大的節省了時間，并滿足了HTS的需要。與通常情況下利用FCM分選攜帶熒光信號的細胞不同，本研究分選未攜帶熒光信號的細胞，需克服背景信號的干擾問題。通過設置空白和陽性對照進行合理的圈門，有利于劃清與無效信號的界限，繼而提高細胞的回收率。目前，功能最為完善的FCM可以同時分析超過50種熒光，從而能對樣品中稀有細胞進行快速富集。實際上，由于選擇合適的熒光標簽能夠區分不同類或生理狀態的細胞，所以特異性染色或表達內源熒光通常對于目標細胞的篩選有事半功倍的作用。本研究結合FCM分選來滿足基于多孔板HTS的需要，卻對FCM分析功能的利用非常有限，這為我們下一步工作提供了改進的空間。

對于桿菌肽合成調控的認知通常停留在由Spo0A，AbrB和σH組成的三組分管理系統［17］。但由于全局調控因子AbrB的改造影響細胞生長的其他過程，所以對于桿菌肽合成調控的研究依然是個難題［18］。地衣芽孢桿菌DW2的全基因組測序已經完成，比較基因組學（Comparative genomics）將在地衣芽孢桿菌的基因組學研究中起著重要的作用［18］。將全基因組重測序與HTS育種相結合，發現有利于桿菌肽合成的變異位點并解析相關突變基因的功能，從理論上指導進一步提高桿菌肽的積累是可行的。與此同時，通過菌株工程能夠在復制、轉錄和翻譯水平上，實現對指定途徑進行遺傳多樣性的隨機操作，爭取從建構突變文庫方面尋找新的突破口［19］。因此，基于上述調查，HTS技術將在桿菌肽產量的研究中繼續發揮作用。

4 結論

本研究建立了一種FCM協助下的HTS方法，基于ARTP誘變獲得突變菌株文庫，并成功從文庫中篩選出桿菌肽高產菌株。這個方法的主要特征在于建立的雙縮脲顯色結合TCA沉淀的高通量初篩方法，并篩選到桿菌肽產量提高超過20%的地衣芽孢桿菌DW2突變菌株。利用FCM將單細胞分選至96孔板中，保證了細胞分選后的活性，使細胞回收率達到95%以上，極大的擴大了篩選規模，從而縮短了育種的周期。