西藏湖泊放線菌的分離鑒定及抗菌活性測定

潘文娟 林家富 王小桃 郭義東 褚以文 劉超蘭

（成都大學四川抗菌素工業研究所 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室，成都 610052）

抗生素耐藥性已成為全球關注的醫學與社會問題，超級耐藥菌嚴重威脅著人類的健康，新型抗生素的研發迫在眉睫［1］。眾所周知，土壤放線菌一直是新抗生素研發的重要來源［2-5］。但隨著研究深入，從土壤中篩選得到新放線菌及新次級代謝產物的概率呈顯著下降趨勢［6-7］，迫使人們從新的生境中篩選新的放線菌資源，如海洋放線菌、動物共生放線菌、植物內生放線菌、極端環境放線菌等［8-12］。而湖泊生境中的放線菌資源開發至今未得到充分重視，尤其是位于高海拔西藏湖泊的放線菌資源研究仍處于空白。

西藏自治區是我國湖泊最多的地區，這些湖泊分為內流湖和外流湖，主要包括造山運動在地層斷裂處積水而形成的斷層湖、冰川形成的冰蝕湖、泥石流使河道堵塞形成的堰塞湖等。西藏湖泊形成原因比較特別，造就了其獨特的生物多樣性，因此，研究西藏湖泊中的放線菌資源及其次級代謝產物對于發現新抗生素先導化合物具有重要意義。我們在西藏湖泊微生物資源調查過程中，對采集于7個湖泊的沉積物樣品進行了放線菌的分離鑒定及抗菌活性測定，本文報道獲得的初步研究結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沉積物樣品 菌株分離用沉積物樣品采集自西藏7個湖泊，包括左用措、納木措、昆仲措、戈芒措、蘆布措、昂仁金措、吉力湖。采集點位于湖中心區域，用淤泥分層采集裝置采集表層沉積物（1-10 cm），樣品存放于無菌試管中，放置4℃保存。采樣信息見表1。

表1 西藏7個湖泊采樣信息

1.1.2 培養基及溶液 （1）分離培養基:ISP2培養基［13］、ISP3 培養基［13］、SCA 培養基［14］、高氏一號培養基［15］，各培養基中均含30 mg/mL萘啶酮酸和放線菌酮。（2）純化培養基:ISP2培養基。（3）發酵培養基:葡萄糖10 g，糊精25 g，燕麥粉20 g，棉籽餅粉10 g，魚粉5 g，糖蜜5 g，干酵母2 g，CaCO33 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.2，121℃高壓滅菌15 min。（4）體外抗菌活性篩選用培養基:LB 細菌培養基［15］，PDA 真菌培養基［15］。（5）NGM線 蟲 培 養 基［16］。（6）M9緩 沖 液:Na2HPO46 g，KH2PO43 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，121℃高壓滅菌15 min，宜現用現配。

1.1.3 線蟲 野生型秀麗隱桿線蟲N2由加拿大戴爾豪斯大學Balakrishnan Prithiviraj博士惠贈，飼養于NGM線蟲培養基中。

1.1.4 檢定菌 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusSIIA1005）、大腸桿菌（Escherichia coliSIIA 1006）、白色念珠菌（Candida albicansSIIA 2284）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisSIIA 1007）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosaSIIA 2261）由中國醫藥集團總公司四川抗菌素工業研究所菌種保藏中心提供。

1.1.5 主要試劑和儀器 引物27F/1492R購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR mix kit購自北京擎科新業生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；萬古霉素、慶大霉素、5-氟-2-脫氧尿嘧啶購自上海源葉生物科技有限公司；放線菌酮購自卡邁舒（上海）生物科技有限公司，萘啶酮酸購自阿法埃莎（天津）化學有限公司。使用儀器如下:超凈工作臺SW-CJ-1FD（蘇州安泰空氣技術有限公司），恒溫培養箱HWS-150（北京中興偉業儀器有限公司），振蕩式搖床THZ-92A（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），高速離心機H1650（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），PCR擴增儀T100（Bio-Rad，美國），凝膠成像儀Gel DocTMXR+（Bio-Rad，美國）、體視顯微鏡SMZ-168（杭州歐爾柏維科技有限公司）、96孔板（Corning，美國）。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 將沉積物樣品自然干燥7 d后，稱取樣品2 g于60℃再干燥1 h后研磨過80目篩。將1 g干燥樣品加入裝有9 mL無菌蒸餾水的試管中，用渦旋振蕩器振蕩均勻，吸取1 mL土壤懸液至9 mL無菌蒸餾水中，進行10倍梯度稀釋，使其終濃度為 10-2、10-3、10-4、10-5。吸取 0.2 mL 稀釋液分別涂布于分離培養基上，于28℃培養30 d，從第7天開始，每天挑取新出現的菌落至純化培養基上進行純化，純化后的菌株用30%甘油保藏于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株分類鑒定及系統發育樹的構建 采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用16S上游引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、下游引物1492R（5'- TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增。PCR擴增體系（25 μL）:PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，DNA 模板 2 μL，引物各 1 μL，擴增程序為:95℃ 5 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 2 min，34個循環，4℃無限延伸。擴增完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物。將結果為陽性的PCR反應產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。利用NCBI數據庫中BLAST程序對測序結果進行比對分析，選擇GenBank中與之同源性較高的模式菌株的16S rRNA基因序列，分析菌株與參比菌株間的序列相似度，利用MEGA6.0［17］軟件，選擇Tamura-Nei模型，構建菌株Maximum Likelihood系統發育樹。

1.2.3 菌株發酵及粗提液制備 將菌株接種于ISP2斜面培養基中于28℃生長10-14 d后，接種到發酵培養基中，于28℃、220 r/min發酵7 d。取20 mL發酵液加入20 mL乙酸乙酯進行萃取，吸取乙酸乙酯層10 mL，旋轉蒸發干燥，加入2 mL甲醇溶解后，備用。

1.2.4 體外抗菌活性篩選 采用紙片擴散法進行抗菌活性檢測。吸取60 μL發酵粗提液至直徑為6 mm的圓形滅菌濾紙片上，待甲醇揮發后，貼于含有檢定菌的培養基上，37℃培養24 h，然后觀察并記錄抑菌圈大小，將抑菌圈直徑大于1 cm作為陽性結果。

1.2.5 體內抗菌活性篩選 （1）線蟲培養:線蟲按照國際標準流程進行培養［18］。（2）線蟲同期化:挑取處于產卵期的成年線蟲于新的NGM平板，于15℃恒溫培養箱培養12 h，待產卵后將成蟲挑出，于20℃恒溫培養箱培養48 h使蟲卵孵化并成長至L4期線蟲。（3）菌懸液制備:挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌落于5 mL的LB液體培養基中，37℃、200 r/min振蕩培養12 h，備用。（4）線蟲抗感染實驗:吸取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液100 μL接種至NGM培養基（含50 μg/mL 5-氟-2-脫氧尿嘧啶，用于抑制線蟲產卵），37℃培養24 h。挑取已同期化的L4期線蟲，于M9緩沖液中反復清洗干凈后備用。將線蟲分別挑取到含有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的平板上，感染時間為14-16 h。96孔板中每孔加入20條已感染的L4期線蟲和190 μL M9緩沖液，其中陽性對照組加入10 μL抗生素（萬古霉素、慶大霉素，終濃度為50 μg/mL），陰性對照組加入10 μL甲醇，空白對照組加入10 μL M9緩沖液，樣品組加入10 μL發酵粗提液，每個發酵粗提液做3個復孔，并于培養箱中20℃靜置培養。（5）線蟲觀察:每隔2 h觀察1次，觀察時間為20 h。正常線蟲保持著正弦S形，并活躍地移動［19］，而死線蟲呈筆直狀。記錄存活和死亡線蟲數量，計算存活率，線蟲存活率（%）=線蟲存活數/線蟲總數×100%。以存活率＞50%為陽性結果。

2 結果

2.1 菌株分離

從西藏7個湖泊沉積物樣品中分離得到73株放線菌（圖1），其中分離自蘆布措湖的菌株數最多，共23株，占比31.5%；分離自昂仁金措湖的菌株數最少，為5株，占比6.8%。

圖1 西藏7個湖泊沉積物樣品分離菌株數

采用不同分離培養基所獲菌株數有差異，ISP2、ISP3、SCA、高氏一號培養基分離菌株數分別為30株、25株、8株和10株，其中ISP2和ISP3培養基是分離西藏湖泊沉積物中放線菌的適用培養基。

2.2 菌株鑒定及系統發育樹構建

根據16S rRNA基因序列，利用Maximum Likelihood和Tamura-Nei模型構建系統發育樹（圖2），結果表明，73株放線菌分屬于5個科8個屬，以鏈霉菌科為主，其次為小單胞菌科、諾卡菌科、鏈孢子囊科、擬諾卡菌科等。鏈霉菌屬（Streptomyces）為優勢屬，共59株，占80.8%，小單孢菌屬（Micromonospora）次之，共7株；其他屬包括諾卡氏菌屬（Nocardia，1株）、北里孢菌屬（Kitasatospora，1株）、小雙孢菌屬（Microbispora，1株）、野野村菌屬（Nonomuraea，1株）、游動放線菌屬（Actinoplanes，1株）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis，2株）。

根據Kim［20］提出的新種16S rRNA臨界值98.65%，分離的菌株中存在潛在新種3株，分別為菌株PF1（Streptomyces pratensisch24T，相似度為98.4%）、 菌 株 PF26（Streptomyces pseudovenezuelaeDSM 40212T， 相 似 度 為 98.25%）、 菌 株 PF188（Nonomuraea guangzhouensisNEAU-ZJ3T，相似度為98.13%）。

不同湖泊所分離到的放線菌種類具有明顯差異。各湖泊所分離菌株的屬水平相對豐度（圖3）表明，Streptomyces是各湖泊的優勢菌屬。而在蘆布措湖的沉積物樣品中發現最多稀有放線菌屬，包括Kitasatospora、Microbispora、Nonomuraea、Actinoplanes，在昆仲措湖沉積物樣品中還分離到Nocardiopsis。

圖2 基于16S rRNA基因序列構建湖泊放線菌的系統發育樹

圖3 西藏7個湖泊沉積物樣品的放線菌屬相對豐度

2.3 菌株發酵粗提液的體外抗菌活性

放線菌發酵粗提液的體外抗菌活性結果總結于表2，73株放線菌中有55株放線菌至少對一種檢定菌表現出抗菌活性，陽性率為75.3%，其中抗金黃色葡萄球菌比例為57.5%，抗枯草芽孢桿菌比例為54.8%，抗白色念珠菌比例為37.0%，抗綠膿桿菌比例為17.8%，抗大腸桿菌比例為11.0%，菌株發酵產物的體外抗菌活性以抗革蘭氏陽性細菌為主。

2.4 線蟲體內抗菌活性

73株菌株發酵提取液的線蟲體內活性結果（表3），顯示8個（11%）發酵粗提液為陽性，其中3株菌株的代謝產物使線蟲存活率達到80%-100%，2株菌株的代謝產物使線蟲存活率達到65%-80%，3株菌株的代謝產物使線蟲存活率達到50%-65%。結合體外抗菌活性結果，其中2個發酵粗提液同時具有體內和體外活性，6個發酵粗提液僅有體內活性而無體外活性。

菌株PF188（Nonomuraeasp.）的代謝產物對感染金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的線蟲均有100%的保護作用，其對感染金黃色葡萄球菌的線蟲體內活性與50 μg/mL的萬古霉素相當，但該代謝產物無體外抗大腸桿菌活性。菌株PF187（Microbispora tritici）的代謝產物具有良好的體外抗金黃色葡萄球菌活性，對感染金黃色葡萄球菌的線蟲有90%保護作用，同時該代謝產物無體外抗大腸桿菌活性，但對感染大腸桿菌的線蟲有60%保護作用。菌株PF33（Streptomyces sparsus）的代謝產物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無體外活性，但對感染金黃色葡萄球菌的線蟲有80%保護作用，對感染大腸桿菌的線蟲有50%保護作用（圖4）。預示菌株PF188、PF187、PF33的代謝產物具有不同于傳統抗生素的作用機制。

3 討論

七個西藏湖泊沉積物中鏈霉菌屬菌株為豐度最高的放線菌優勢菌屬，與羅紅麗等［21］和夏占峰等［22］報道的研究結果基本一致。小單孢菌屬是僅次于鏈霉菌屬的優勢菌屬，在左用措、昆仲措、戈芒措、昂仁金措、吉力湖中均有分布，而在納木措和蘆布措中未分離得到。比較各湖泊生態環境參數，推測小單孢菌屬的分離頻度與湖泊的pH值呈正相關，與張學武［23］報道的小單孢菌屬是分布于低溫、堿性水體生境中的優勢菌屬的研究結果一致。近年來，國內外許多學者從湖泊生境分離獲得大量放線菌。如夏占峰等［22］采用不同鹽濃度的9種選擇性培養基從艾丁湖沉積物中分離放線菌，獲得8個屬的55株放線菌；Zothanpuia等［24］從印度東北部淡水湖泊分離得到9個屬的68株放線菌。而本研究分離菌株數相比其他類似研究偏少［25］，其原因除了生態環境因素外，可能與預處理方法單一、分離培養基設計未考慮鹽度因素等有關。深入挖掘西藏湖泊放線菌資源的多樣性，需要結合湖泊水體的物理化學參數，從培養基設計、樣品預處理方法等多個環節建立優化的分離體系。

表2 西藏湖泊放線菌的體外抗菌活性統計結果

圖4 三株菌株代謝產物對感染致病菌的線蟲的保護作用

表3 西藏湖泊放線菌陽性菌株的體內外抗菌活性統計結果

秀麗隱桿線蟲作為一種模式生物，因蟲體較小、通體透明、生命周期短、易于實驗室培養，近年來被廣泛應用于藥物高通量篩選中［26-27］。利用秀麗隱桿線蟲感染模型，除了可以篩選得到體內外均有抗菌活性的化合物外，還可以獲得僅有體內活性而無體外活性的化合物，包括作用于致病菌毒力因子或增強宿主免疫力的抗菌物質［28-29］。線蟲感染方法分為固體平板法和液體法，大多數學者采用液體感染法的原因主要由于其操作簡便、數據偏差較小。本研究采用秀麗隱桿線蟲模型篩選獲得的活性菌株次級代謝產物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有良好的抑制作用，對這些次級代謝產物開展活性化合物分離純化、結構解析和作用機制研究，有望獲得具有新作用機制的抗菌先導化合物。

4 結論

（1）從西藏7個湖泊中分離得到73株放線菌，分屬于4個目5個科8個屬，其中含有潛在新種3株，鏈霉菌屬和小單孢菌屬為優勢菌屬。（2）放線菌發酵粗提液體外抗菌活性結果中，對至少一種檢定菌具有抗菌活性的菌株數為55株。采用秀麗隱桿線蟲體內抗菌活性篩選模型，篩選獲得陽性菌株數8株，其中菌株PF33（Streptomyces sparsus）、PF187（Microbispora tritici）、PF188（Nonomuraeasp.）具有強大的線蟲體內廣譜抗菌活性，值得深入研究。