雷公藤紅素與凋亡蛋白突變體通過強化Nur77誘發凋亡通路發揮協同抗腫瘤作用

尹曉夢 曹雪瑋 王富軍 趙健 張惠展

（1. 華東理工大學生物反應器工程重點實驗室，上海 200237；2. 浙江孚諾醫藥股份有限公司，東陽 322100；3. 上海中醫藥大學中藥研究所，上海 201203）

Nur77轉錄因子，又稱為神經生長因子誘導的基因B（Nerve growth factor-induced gene B，NGFI-B）或TR3，是一種類固醇/甲狀腺/類視黃醇受體超家族的孤兒核受體蛋白（Orphan nuclear receptor），在多種細胞的信號轉導、細胞周期、細胞凋亡的調節中起重要作用［1-3］。作為早期轉錄因子之一，Nur77定位于細胞核內，起到激活轉錄，促進細胞生長的作用。因此，Nur77在多種腫瘤細胞中的表達量遠超于正常細胞［4］。當受到凋亡信號刺激時，Nur77在磷酸激酶作用下被磷酸化，隨之磷酸化的Nur77離開細胞核到達線粒體，與B細胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）結合并誘導其構象改變，引發細胞色素C（Cytochrome C）釋放，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase 9）并進一步激活Caspase級聯反應下游的Caspase 3蛋白，最終誘導細胞凋亡［5-6］。由于磷酸化的Nur77直接調控線粒體途徑的凋亡過程，因此，圍繞以Nur77為作用靶點來進行相關腫瘤治療藥物的開發引起了人們的日益關注［3］。

雷公藤紅素（Celastrol）是從傳統中藥材雷公藤植株中提取的一種藥用化合物［7］，結構如圖1-A所示，其具有抗氧化、抗癌、抗類風濕，減肥等廣泛的生物學活性，尤其是其抗腫瘤活性受到人們的廣泛關注［8］。已有研究表明，Celastrol可以抑制肝癌、骨髓癌、乳腺癌、胰腺癌和胃癌等多種人類腫瘤細胞增殖并激活內源性細胞凋亡途徑［7，9-11］，通過Bcl-2家族蛋白介導引起線粒體膜通透性改變，釋放細胞色素C等凋亡相關因子引發細胞凋亡［12-14］。對誘發細胞凋亡機理的深入研究發現，Celastrol進入細胞后與Nur77結合，促使Nur77從細胞核轉移至線粒體，這種易位使NF-κB激酶抑制劑表達增加導致具有抗凋亡活性作用的NF-κB信號因子數量降低，最終誘發細胞凋亡［15-16］（圖 1-B）。

來源于雞貧血病毒的凋亡蛋白（Apoptin）是一種為數不多的能特異性誘導腫瘤細胞凋亡而不影響正常細胞生長的蛋白。Apoptin進入腫瘤細胞后，能滯留在腫瘤細胞核內，誘發腫瘤細胞凋亡，但其在正常細胞中則會被轉運到胞質中降解，因此Apoptin可以誘導眾多腫瘤細胞系凋亡而對正常細胞不產生毒副作用［17-18］。類似于Celastrol，Apoptin也是通過促進核內Nur77的磷酸化，使得Nur77從細胞核轉移到達線粒體，從而激活內源性凋亡通路，誘導腫瘤細胞凋亡［6，19］（圖 1-B）。

圖1 Celastrol結構示意圖（A）和Celastrol、Apoptin誘導細胞凋亡的分子機制示意圖（B）

由于Celastrol與Apoptin抑制腫瘤生長的作用機理都與Nur77相關，本研究嘗試探討這兩種藥物聯用是否可以通過協同增強Nur77途徑的細胞凋亡誘導作用，來加強藥物的抗腫瘤藥理作用效果。野生型的Apoptin由于其本身多肽鏈一級結構的原因，在通過原核表達系統重組表達時大都以包涵體形式表達，易產生聚集沉淀現象［5，20-21］。本課題組在前期研究中制備了一種Apoptin的突變體tApoptin，實現了在原核表達系統中的可溶性表達，并且在商陸皂苷甲（EsA）存在下表現出顯著的抗腫瘤效果［22］（簡稱為tApoptinE）。本研究首先通過MTT實驗考察了Celastrol與tApoptinE兩者聯用是否對不同腫瘤細胞的增殖抑制存在協同作用，隨后通過流式凋亡分析和免疫印跡（Western blot）技術進一步分析了Celastrol與tApoptinE聯用后抗腫瘤活性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞（SMMC-7721，簡稱SMCC）、人宮頸癌細胞（HeLa）、人非小細胞肺癌細胞（A549）、人胚肺細胞（MRC-5）、tApoptin-pET28a均為本實驗保存。表達宿主菌為E.coliBL21（DE3）。卡那霉素（Kan）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、噻唑藍（MTT）等均購自碧云天公司。商陸皂苷甲（EsA）購自新鉑化學技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 體外細胞培養 SMMC、HeLa、A549和MRC-5細胞均采用RPMI-1640培養基（10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素）。所有細胞置于含5% CO2，37℃培養箱中培養。

1.2.2 藥物體外生長抑制實驗（MTT法） 各種細胞按1×104/孔接種至96孔細胞板中，培養24 h。檢測單藥對SMMC細胞生長抑制作用時，將不同濃度（62.5、125、250、500、1 000 nmol/L） 的 Celastrol或tApoptinE分別與SMMC細胞孵育24 h，tApoptinE為混合了50 μmol/L EsA的tApoptin；檢測聯合用藥作用效果時，分別在不同濃度的Celastrol（75、150、300、600、1 200 nmol/L）存在下，濃度梯度的tApoptinE（62.5、125、250、500、100 nmol/L） 與SMMC細胞孵育24 h，Celastrol與tApoptinE混合后同時與細胞共孵育。然后棄掉細胞板中培養基，每孔加入200 μL含5 mg/mL MTT的溶液后培養箱中繼續培養2 h。棄掉MTT溶液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振動溶解甲瓚，以Thermo酶標儀（吸收波長為490 nm）測定吸光度，計算細胞存活率。

1.2.3 流式細胞術凋亡分析 每孔1×104個SMMC細胞接種到24孔板中，于含5% CO2，37℃培養箱中培養24 h。對照組中分別加入600 nmol/L Celastrol，65、125、250 nmol/L tApoptinE；實驗組分別為與600 nmol/L Celastrol混合的65、125、250 nmol/L tApoptinE。藥物與細胞共孵育24 h之后收獲各組細胞并進行兩次PBS洗滌，以100 μL結合緩沖液重懸細胞，加入10 μL Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）1∶1混合液，20℃黑暗孵育細胞20 min，加入400 μL結合緩沖液。通過FACScan流式細胞儀對經處理的樣品進行分析。

1.2.4 免疫印跡分析 每皿1×107個SMMC細胞接種到55 cm2的培養皿中，于含5% CO2，37℃培養箱中培養12 h至貼壁。每組分別加入600 nmol/L Celastrol，65、125、250 nmol/L tApoptinE 和62.5 nmol/L tApoptinE + 600 nmol/L Celastrol、125 nmol/L tApoptinE + 600 nmol/L Celastrol、250 nmol/L tApoptinE + 600 nmol/L Celastrol，并設置一組無試劑添加的空白對照組。藥物與細胞共孵育24 h后收獲細胞，裂解細胞獲得全細胞裂解物，12 000 r/min離心15 min取上清蛋白。通過BCA蛋白定量試劑盒測定各組上清蛋白濃度，然后再用裂解液將各組上清稀釋至同一蛋白濃度。以SDS上樣緩沖液處理稀釋后細胞裂解液，之后進行SDS聚丙酰胺凝膠蛋白電泳分離樣品，然后將凝膠泳道中的蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。之后，將膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中常溫封閉過夜，再以PBS洗滌膜3次。將封閉處理后的膜與特異性一抗4℃孵育8 h，以PBS洗滌膜3次。隨后將與一抗孵育后的膜與辣根過氧化物酶綴合的二抗室溫孵育1 h，以PBS洗滌3次。最后用ECL化學發光超敏顯色試劑盒對膜進行顯像，并用化學成像系統拍照。

1.2.5 聯合作用指數（Combined index，CI） 計算兩種藥物聯用是否具有協同效應是通過CI值來判斷的，CI值小于1則說明藥物聯用具有協同作用［23］。在Compusyn軟件（Version 1.0，Combo SynInc，USA）中分別輸入單獨用藥和聯合用藥各組藥物的濃度和細胞抑制率來計算CI值來判斷藥物間協同作用的大小。

2 結果

2.1 聯合用藥對腫瘤細胞生長的抑制作用的MTT法分析

為了分析Celastrol與tApoptinE兩者聯用是否能對腫瘤細胞的生長產生協同抑制作用，固定濃度的Celastrol與tApoptinE聯用，利用細胞生長抑制實驗檢測二者聯合的作用效果。分別在不同Celastrol的固定濃度下（0、75、150、300、600、1 200 nmol/L）觀察tApoptinE濃度變化（62.5-1 000 nmol/L）對腫瘤細胞SMMC生長抑制效應，MTT結果顯示，Celastrol提高了tApotpinE對SMMC細胞的生長抑制活性，并且該效果具有濃度依賴性:低濃度的Celastrol（75、150 nmol/L）對tApoptinE的作用效果基本沒有影響；當Celastrol達到300 nmol/L時一定程度上提高了tApoptinE的抗腫瘤活性，tApoptinE對SMMC細胞的生長抑制能力從Celastrol不存在時的IC50值717.7 nmol/L下降到270.1 nmol/L；當Celastrol ≥ 600 nmol/L時（600、1 200 nmol/L）顯著提升了tApoptinE對SMMC細胞的生長抑制作用，tApoptinE對SMMC細胞的IC50值分別降至48.63、45.74 nmol/L（圖2-A，表1）。這些結果表明，≥300 nmol/L的Celastrol與不同濃度tApoptinE聯合用藥可對SMMC細胞的生長活性產生更好的抑制效果。

CI值可以判斷兩種藥物聯用是否具有協同效應，CI值小于1則說明藥物聯用具有協同作用。CI值計算結果顯示，低濃度Celastrol（75、150 nmol/L）與不同濃度tApoptinE聯合用藥其CI值1左右，尚未表現出協同作用；當Celastrol達到300 nmol/L時，CI值明顯小于1，體現出了一定的協同效應；當Celastrol為600 nmol/L時，CI值最低（圖2-B）。這說明當tApoptinE與高于300 nmol/L的Celastrol聯用時，這兩種藥物的聯用存在顯著的協同效應且Celastrol為600 nmol/L時協同效果最佳。因此后續實驗選取CI值最低的600 nmol/L Celastrol作為聯用的固定濃度。

圖2 Celastrol與tApoptinE單獨及聯合用藥24 h對SMMC細胞的生長抑制效果分析（A）及聯合用藥協同指數CI值（B）

表1 不同Celastrol固定濃度下tApoptinE對SMMC細胞24 h的半抑制濃度（IC50）

2.2 聯合用藥抑制腫瘤細胞生長的流式細胞術分析

為了闡明Celastrol與tApoptinE聯用后對腫瘤細胞的協同抑制效應的分子機制，我們以Annexin V-FITC/FACS方法對聯合用藥后的腫瘤細胞凋亡率進行了檢測分析。如圖3所示，左上的Q1區代表含有獨立細胞核但是細胞膜破損嚴重的細胞，左下的Q4區代表正常的活細胞，右上的Q2區代表晚期凋亡或者死亡的細胞，右下的Q3區代表早期凋亡的細胞，凋亡率為早期凋亡率（Q3）與晚期凋亡率（Q2）結果相加，經計算后得到如下結果:與SMMC細胞孵育24 h后，單獨使用Celastrol（600 nmol/L）處理的，僅產生29.2%的細胞凋亡率；單獨使用62.5 nmol/L、125 nmol/L和250 nmol/L濃度的tApoptinE時，誘導SMMC的細胞凋亡率分別為22.09%、33.61%和43.9%；而當上述相應濃度tApoptinE與600 nmol/L Celastrol聯合用藥時，誘導細胞的凋亡率分別達到了71.6%、79.2%和76.7%（圖3-A-B），即在不同tApoptinE濃度下的誘導凋亡率均提高了2-3倍。因此，Celastrol與tApoptinE聯用后的生長抑制作用的增強是通過提升對腫瘤細胞的誘導凋亡效應來實現的。

2.3 聯合用藥產生的協同效應與Nur77表達量相關

上述流式細胞術凋亡分析實驗的結果表明Celastrol與tApoptinE聯合用藥在SMMC細胞中存在協同作用的原因使Celastrol與tApoptinE聯用后強化了對SMMC細胞的凋亡誘導效應。因為這兩種藥物都是通過Nur77的磷酸化來激活細胞凋亡通路，所以本課題組進一步通過免疫印跡實驗來比較分析這種誘導作用的增強是否與Nur77的表達量相關。分析MRC-5、SMMC、HeLa和A549四種細胞的Nur77表達量，發現Nur77在SMMC、HeLa和A549三種腫瘤細胞中的表達量顯著超過在正常細胞MRC-5中的表達量（圖4-B）；而這種差異性與MTT實驗結果顯示的兩種藥物聯合用藥對細胞生長的抑制作用效果呈正相關:在相同用藥濃度下，對正常細胞的生長幾乎無生長抑制作用，但對所有測試的腫瘤細胞（SMMC、HeLa和A549細胞）均有明顯的協同抑制作用（圖4-A），與600 nmol/L celastrol聯用后tApoptinE對SMMC、HeLa和A549細胞的IC50值分別為0.013 29、24.13、48.35 nmol/L，在SMMC細胞中表現最高抑制活性。因此，Celastrol與tApoptinE無論是單獨用藥還是聯合用藥的協同抑制作用效果與Nur77表達量直接相關。

2.4 聯合用藥可提高Nur77的磷酸化水平

上述實驗證明了Celastrol與tApoptinE的聯合用藥導致的細胞生長抑制效應與胞內Nur77的表達量直接相關，本研究進一步通過免疫印跡實驗檢測了胞內磷酸化的Nur77（p-Nur77）的蛋白水平。結果如圖5所示，與空白對照組相比，單獨使用Celastrol或tApoptinE處理后，可顯著上調細胞內p-Nur77的表達；而當Celastrol與tApoptinE聯用后，又進一步上調了p-Nur77的表達。這一結果表明Celastrol與tApoptinE聯用后進一步誘導Nur77發生磷酸化，促使NuR77傳遞凋亡信號，從而實現加強誘導細胞凋亡效果。

2.5 聯合用藥對Caspase家族蛋白和線粒體凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響

為了明確磷酸化的Nur77誘導細胞凋亡更具體的分子機制，我們分析了聯合用藥后在細胞線粒體凋亡過程中起重要作用的Caspase家族蛋白和Bcl-2家族蛋白的表達量。

圖3 聯合用藥對SMMC細胞的流式細胞術凋亡檢測（A）及SMMC細胞的凋亡率直方圖（B）

若 Caspase 3、Caspase 8和 Caspase 9表 達 水平下調則預示著級聯反應被激活、細胞凋亡啟動。Western blot實驗結果顯示，在經單獨的Celastrol或tApoptinE處理后這3種蛋白的表達水平相對于空白對照組均有所下調，并且在Celastrol與tApoptinE聯合處理的細胞中，3種蛋白表達量的下調更加顯著（圖6-A，6-C）。同時，Bax/Bcl-2比值上升時可以激活下游線粒體死亡級聯反應、引發細胞凋亡，在經過單獨的Celastrol或tApoptinE處理后Bax/Bcl-2比值增大，并且，在聯合用藥組中該現象更加明顯（圖6-B，6-D）。上述結果表明，Celastrol與tApoptinE單獨用藥時可以調控Caspase和Bcl-2家族蛋白的表達，激活細胞的線粒體凋亡通路，而兩者聯用后產生協同作用，使得該通路被進一步激活。并且，上述過程伴隨Nur77磷酸化進行，暗示磷酸化的Nur77通過調控Caspase和Bcl-2家族蛋白的表達誘導細胞凋亡。

3 討論

結合兩種或者兩種以上治療藥物的聯合用藥法因具有臨床優勢而成為腫瘤治療的常規方式［24］，除了降低新藥研發成本，聯合用藥還可以克服很多單藥治療帶來的局限性［25］。首先，聯合用藥的藥物會以特征性協同或者相加的方式作用于多種關鍵途徑，由此取得更好的抗腫瘤效果［26］；其次，聯合用藥可以解決由于單一化合物持續治療，從而誘導癌細胞招募替代的挽救途徑引起的耐藥性問題，增加藥物在胞內積累［27］；療效的提升和更少耐藥性的誘導效應使得單一藥物的使用劑量總體都得以降低，從而減輕了藥物所帶來的全身性毒性［28］；最后，聯合用藥的應用降低了相同療效下單藥治療的不良反應。因此，探索腫瘤治療的新的聯合用藥方式具有非常重要的實際應用價值。對于Celastrol來說，He等［29］曾發現Celastrol可以抑制藤黃酸（Gambogic acid，GA）在發揮抗腫瘤作用中引發的NF-κB激活，從而增強腫瘤細胞對GA的敏感性，取到增強療效的效果。

圖4 單獨或聯合用藥對不同細胞生長的抑制作用 其中對照組為無任何藥物處理，只含有培養基的細胞（A）及不同細胞內的Nur77表達量（B）

表2 tApoptinE在600 nmol·L-1 celastrol存在下對不同細胞的48 h半抑制濃度（IC50）

圖5 單獨及聯合用藥后SMMC細胞中Nur77表達量及磷酸化水平（A）及蛋白量的直方圖（B）

圖6 單獨及聯合用藥后SMMC細胞中Caspase家族蛋白表達量（A）和蛋白量直方圖（C）及Bcl-2家族蛋白表達量（B）和蛋白量直方圖（D）

作為一種已研究比較全面的五環三萜類化合物，Celastrol是中藥雷公藤（Thunder God Vine）中的一種重要生物活性成分［30］。在過去的10年里，越來越多的研究強調Celastrol在不同臨床領域的醫用價值［31］。數據表明，由于能夠抑制NF-κB途徑，干擾促炎細胞因子和趨化因子的產生，以及炎癥細胞的遷移、增殖和活化，Celastrol作為抗炎化合物治療風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、骨關節炎和過敏等疾病具有巨大潛力［32-35］；Celastrol可以通過抑制NF-κB和HSP來治療神經退行性疾?。ɡ绨柶澓ＤY）［36］；最新數據顯示Celastrol還可以應用在糖尿病、肥胖癥、動脈粥樣硬化和聽力喪失等疾病的治療中［37-40］。此外，Celastrol的抗癌特性一直備受關注，Celastrol可以應用于肝癌、骨髓癌、乳腺癌、胰腺癌和胃癌等多種腫瘤的治療，這主要是由于其能夠抑制轉錄因子（如NF-κB和HIF-1α），以及蛋白質穩態的介質（如HSP90伴侶）［41-42］。但是，當應用到腫瘤臨床治療時，Celastrol的使用仍受到限制:一方面，Celastrol的長期使用伴隨著全身毒性和多種不良反應，如體重減輕、血液毒性、肝損傷和生殖障礙［43］；另一方面，Celastrol在細胞內發揮作用時所產生的其他反應不是我們期望的，例如，Zheng等［44］發現Celastrol會下調維持細胞黏附和抑制細胞遷移功能的鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達，從而降低腫瘤細胞對Celastrol的敏感性。因此，我們如果能通過藥物聯用的方式在保證發揮Celastrol抗腫瘤治療效果的同時，降低Celastrol的用量，就可能減少Celastrol的臨床應用所帶來的毒性反應和其他不良反應。

由雞貧血病毒的VP3基因編碼的Apoptin具有在不損害正常細胞的基礎上特異性殺死腫瘤細胞的特性［18］。但是，盡管Apoptin的這種選擇性抗腫瘤的能力在上世紀末就被發現，但20多年來由于Apoptin本身的一級結構特點（N端富集亮氨酸，蛋白易產生聚集沉淀），給它的表達純化帶來困難，限制了其應用［21］。有研究表明，去掉Apoptin N端的43個氨基酸后獲得的突變體tApoptin可以在原核細胞中實現可溶性表達，并且仍對腫瘤細胞保持生長抑制活性，但引起細胞凋亡的效應有所降低［20］。如果要保持tApoptin原有的抗腫瘤活性，就需要大大提高用藥量。因此，我們課題組前期通過tApoptin與EsA聯合用藥的方式（tApoptinE），使得tApoptin的藥效顯著提高［22］。

由于Celastrol與tApoptin都以Nur77途徑誘導細胞凋亡起到抗腫瘤作用，所以我們將這兩種藥物聯用。MTT結果顯示，濃度固定的Celastrol與tApoptinE聯用后可以提升tApoptin的抗腫瘤效果，尤其是同較低濃度的Celastrol（75、150、300 nmol/L）聯用相比較，tApoptinE與600 nmol/L或者1 200 nmol/L的Celastrol聯合用藥更加顯著地提高單獨tApoptinE對腫瘤細胞SMMC的生長抑制作用，并且這兩組的藥效提升效果接近。這可能是由于Celastrol本身對細胞抑制活性較弱，所以當低濃度的Celastrol與tApoptinE聯用時由于Celastrol濃度較低不能很好地發揮提高tApoptinE活性的作用，而當Celastrol提高到一定濃度時，二者聯合對細胞生長有較強的抑制作用，藥效達到峰值很難再提升。

CI值小于1表示兩藥具有協同作用［45］，當與tApoptinE聯用的Celastrol濃度高于300 nmol/L時，聯用組CI值均小于1，這說明在某些濃度范圍內Celastrol與tApoptinE聯用后確實存在協同作用。此外，600 nmol/L Celastrol與tApoptinE聯用后，CI計算所得的值為所有Celastrol組中最低，CI值越低表示協同效果越好［46］，因此可以判斷，600 nmol/L Celastrol與tApoptinE聯用后協同作用在所有聯用組中最強。文獻報道在一些特定的情況下，兩種藥物的協同效應僅在一定的藥物濃度范圍內才能體現，特別是其中一種藥物濃度過高易使得協同效果反而不明顯［47］，據此推斷，當Celastrol濃度過低時（75、150 nmol/L），Celastrol尚未達到與tApoptinE協同抗腫瘤的條件，因此兩藥聯用不表現正協同作用；當Celastrol濃度高達1 200 nmol/L時，單藥對腫瘤細胞的生長抑制作用已非常強，所以協同效果不如600 nmol/L Celastol?？紤]到 Celastrol的細胞毒性［43］，在保障協同作用及藥效的情況下盡可能地降低Celastrol用量，因此我們選擇600 nmol/L的Celastrol作為固定聯用濃度。

對聯合用藥的流式凋亡分析實驗表明，協同作用加強了對細胞的凋亡誘導效應。通過Western blot實 驗 分 析 MRC-5、SMMC、HeLa和A549四種細胞的Nur77表達量，并結合Celastrol（600 nmol/L）與不同濃度tApoptinE聯用對上述四種細胞的MTT實驗結果顯示，在相同用藥濃度下，聯合用藥對Nur77低表達的正常細胞不表現協同抑制作用，生長抑制作用小；但對Nur77高表達的腫瘤細胞（SMMC、HeLa和A549細胞）均有明顯的協同抑制作用，生長抑制作用強。進一步表明這兩種藥物的細胞生長抑制作用必須通過Nur77這個靶點才能實現。此外，Celastrol與tApoptinE聯用具有一定的靶向作用效果，其對Nur77高表達的細胞更具殺傷性。這種增強誘導細胞凋亡效應直接與Nur77的表達量呈正相關。

Nur77途徑的誘導凋亡效應只有在Nur77磷酸化，并且磷酸化的Nur77移動到線粒體才能進行觸發內源性細胞凋亡［48］。從Western blot的結果可以看到Celastrol或tApoptinE單獨給藥后均可以誘導Nur77發生磷酸化，上調Bax/Bcl-2比值，活化Caspase 9以及下游的Caspase 3，引發細胞凋亡［49］。這一方面證實了Celastrol與tApoptinE在胞內發揮誘導細胞凋亡作用是通過共同作用于Nur77通路來實現的；另一方面也顯示了聯合用藥組Nur77的磷酸化水平提高更為顯著，引起Bcl-2家族蛋白和Caspase家族蛋白相關變化更加顯著。因此Celastrol與tApoptinE的聯合用藥可利用兩種藥物間的正協同效應提升抗腫瘤作用效果，降低這兩種藥物各自的使用量，從而有可能減少不良反應的發生，促進這兩種藥物的臨床應用開發進程。

4 結論

本研究證實Celastrol與tApoptinE聯合用藥對多種Nur77高表達的腫瘤細胞存在協同抑制作用，能夠在提升藥效的同時降低用藥劑量，聯用的藥物協同作用于同一條Nur77誘發的細胞凋亡通路，強化激活線粒體凋亡途徑，誘導細胞凋亡。本研究提出的聯用方案為聯合用藥治療癌癥提供了新的策略。