植物去甲基化酶ROS1的研究進展

王杰 解莉楠

（東北林業大學生命科學學院 東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

表觀遺傳學是指基于非基因序列改變導致的基因表達水平的變化，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑和非編碼RNA調控等。在高等真核生物中，DNA甲基化發生于胞嘧啶第五位碳原子上，是一種重要的表觀遺傳學修飾，可以調節基因組轉錄、細胞分化、基因印跡、轉座因子沉默等生物學過程［1-5］。DNA甲基化水平由DNA甲基化和DNA去甲基化動態調控，甲基化維持失敗和去甲基化酶主動去甲基化都可以影響甲基化水平［6］。

在植物中，DNA甲基化的建立和維持已經得到充分了解，而對于DNA主動去甲基化機制還知之甚少。DNA主動去甲基化不僅對于全基因組表觀遺傳重編程至關重要，在植物發育過程中還介導基因座特異性基因激活［7］。DNA去甲基化包括DNA主動去甲基化和被動去甲基化2種類型。DNA主動去甲基化不依賴于復制，但是需要一定的酶活性。擬南芥編碼4種DNA去甲基化酶，DEMETER（DME）、REPRESSOR OF SILENCING1（ROS1）、DEMETER-LIKE 2（DML2）和 DEMETER-LIKE 2（DML3）［8］。而DNA被動去甲基化依賴于DNA復制，是指復制后缺乏DNA甲基轉移酶活性或缺乏甲基供體導致甲基化無法維持。ROS1是首先報道的植物中去甲基化酶［9］，它不僅具有糖基化酶活性，還具有AP裂解酶活性，能切開DNA骨架。研究植物體內ROS1對進一步探究去甲基化具有重要意義。有關研究表明去甲基化酶在細胞分化和轉座子沉默中發揮關鍵作用，影響基因表達和果實成熟［10］，但潛在的酶促機制仍不清楚。本文重點關注去甲基化酶ROS1在植物中的研究進展，總結近幾年去甲基化酶ROS1的發現和探究、在主動去甲基化機制方面的研究進展和其在植物發育過程中的功能。

1 植物體中去甲基化酶ROS1的發現和探究

1.1 ROS1具有DNA糖基化酶活性

2002年，鞏志忠課題組使用RD29A-LUC（luciferase）系統篩到了參與DNA去甲基化過程的突變體ROS1，且體外證實ROS1具有DNA糖基化酶的活性［9，11］。2006 年，Agius等［12］報道了 ROS1的生化特性及其過表達對靶基因DNA甲基化的影響，表明ROS1是5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶/裂解酶，參與擬南芥中的DNA主動去甲基化，為以后植物中DNA主動去甲基化的研究奠定了基礎。后經多項研究，從紫花苜蓿（Medicago truncatula）、菜 豆（Phaseolus vulgaris）、 車 軸 草（Trifolium pratense）、 擬 南 芥（Arabidopsis thalianaColumbia）、鼠 耳 芥（Arabidopsis halleri）、 白 菜（Brassica rapaFPsc）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）、 玉 米（Zea mays）、 水 稻（Oryza sativa）、地錢（Marchantia polymorpha）11個物種中克隆獲得ROS1的同源基因（圖1），進化分析顯示ROS1在多個物種中都很保守，表明ROS1在不同物種中都具有去甲基化的功能。

1.2 ROS1主動去甲基化途徑

DNA主動去甲基化過程在塑造甲基化模式中起著關鍵作用，但其中機制仍然不清晰。植物和動物共有5 mC，但DNA去甲基化系統獨立進化，具有不同的機制［13］。在植物發育過程中，DNA主動去甲基化是由5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶ROS1家族起始的，其通過堿基切除修復途徑啟動DNA主動去甲基化［14］，調節真核生物中的DNA甲基化水平。DNA去甲基化酶ROS1在CG、CHH、CHG三種維持型甲基化類型中都具有切除5mC的活性。當其執行去甲基化功能時，先通過水解DNA脫氧核糖核苷酸和堿基之間的糖苷鍵將甲基化的胞嘧啶去除，然后通過它們具有的裂解酶活性在DNA鏈上的無堿基位點切開一個缺口（圖2）［15］。研究表明ROS1去除甲基化的胞嘧啶堿基后，在無堿基位點通過連續的 β-和 β，δ-切除反應切割其底物 DNA［16-17］。β-切除在DNA鏈缺口的3'端產生一個3'-PUA（磷酸-α，β結構不飽和醛），β，δ-切除在DNA鏈缺口的3'端產生一個 3'-磷酸基團［17］（圖 2）。3'-PUA 和 3'-磷酸基團分別在相關蛋白DNA磷酸酶ZDP、脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶APE1L的作用下轉變為可被下游DNA聚合酶識別的3'-羥基（圖2）以便DNA聚合酶和連接酶活性可以填補間隙，再通過DNA連接酶完成去甲基化整個過程，最后在3'末端添加一個未甲基化的胞嘧啶［17-18］。

1.3 ZDP、APE1L與ROS1共同作用DNA主動去甲基化途徑

通過使用ZDP特異的抗體在擬南芥葉核中對ZDP進行免疫熒光定位試驗，結果表明，核質ZDP信號與ROS1共定位［19］。通過免疫熒光共定位［20］試驗，也已證明APE1L與細胞亞群中不同亞核結構中的DNA去甲基酶ROS1在體內共定位。將ROS1與51-mer雙鏈DNA底物（51-mer duplex DNA substrate，在5'-末端標記鏈的第29位含有5-meC殘基）一起孵育并將產物進行純化分析，顯示ZDP催化β，δ-消除產生的3'-磷酸末端轉化為3'-羥基；β-消除產生3'-PUA與APE1L蛋白組合產生3'-OH末端。研究發現來自zdp突變體植物的提取物不能在體外完成DNA去甲基化，這些突變使DNA甲基化水平升高，從而導致基因沉默［19］。APE1L具有有效的3'-磷酸二酯酶活性，可有效加工ROS1產生的3'-PUA阻斷末端，APE1L功能障礙導致DNA甲基化的全基因組改變，APE1L和ZDP的雙突變導致胚乳中DNA高甲基化和印跡基因的下調［18］。在擬南芥中，X射線交叉互補組蛋白1（x-ray crosscomplementing group protein 1，XRCC1） 在 DNA 主動去甲基化過程中起作用，其在體外與ROS1和ZDP相互作用并刺激它們的酶活性［21］，研究發現xrcc1突變體植物的提取物中，去甲基化酶ROS1的去甲基化能力降低。

圖1 植物ROS1同源蛋白系統進化

1.4 主動去甲基化過程中DNA連接酶LIG1的發現

ROS1介導的DNA主動去甲基化過程中產生3'羥基后，下游的聚合酶和連接酶可以在這個缺口填充未甲基化的胞嘧啶。迄今為止，在擬南芥DNA主動去甲基化的最后一步中起作用、產生磷酸二酯鍵并連接DNA鏈兩端的DNA連接酶是AtLIG1（圖2），而這個途徑中的DNA聚合酶作用尚不清楚。LIG1對于母體印跡基因的去甲基化和活化是必不可少的［22-23］。通過共免疫定位測定，發現AtLIG1與核質灶中的ROS1共定位，與細胞核和核質中的APE1L共定位，與核質中ZDP共定位，表明AtLIG1與ROS1、APE1L、ZDP在DNA主動去甲基化途徑中一起發揮作用［23］。雜合突變體atlig1-1（Col背景）和atlig1-3（C24背景）植株的生長發育均出現異常，LIG1的RNAi系也表現出嚴重的矮化表型，通過亞硫酸氫鹽測序證實AtLIG1 RNAi系在CG背景下顯示該基因座處的DNA高甲基化，進一步證明AtLIG1是去甲基化過程中的重要組成部分［23］。

圖2 堿基切除修復（BER）途徑介導植物中DNA主動去甲基化［18］

2 植物體中去甲基化酶ROS1的調節機制

2.1 ROS1靶向DNA主動去甲基化的機制

已有研究表明組蛋白乙酰轉移酶增加DNA甲基化 1（Histone acetyltransferase increased DNA methylation1，IDM1）是一種his-tone H3乙酰轉移酶（Histone H3 acetyltransferase），是擬南芥中DNA去甲基化的調節因子［24］，在遺傳學上與ROS1處于同一途徑，在ROS1靶向途徑中起作用。

抗沉默蛋白復合物包括IDM1（ROS4）、IDM2（ROS5）、IDM3（Increased DNA methylation2-like1，IDL1）、甲基- CpG結合蛋白7（Methyl-CpG-binding protein 7，MBD7）、先驅轉座子衍生蛋白1（Harbinger transposon-derived protein1，HDP1）、 先 驅 轉 座 子衍 生 蛋 白 2（Harbinger transposon-derived protein1，HDP2），它們能夠分別形成復合物，并在ROS1靶向機制中起作用［25-29］（圖2）。MBD7和 HDP2能結合DNA，共同確保IDM1靶向于CG高甲基化區域；IDM2和IDM3在連接IDM1和MBD7中發揮作用；HDP1介導IDM1和HDP2之間的交互；IDM2和IDM3可以作為調節IDM1酶活性的分子伴侶。

染色質重塑復合體（SWR1）的組分包括PIE1、ARP6和SWC6（圖2），SWR1復合物可以與2個含溴結構域的蛋白質NPX1和AtMBD9結合［30］。最新研究結果表明含有溴結構域的蛋白質NPX1和AtMBD9識別由IDM1建立的乙酰化組蛋白標記，并有助于將SWR1復合物吸引到染色質上，SWR1復合物中的ARP6和PIE1能將H2A.Z沉積到染色質中，最后H2A.Z與ROS1直接相互作用從而招募ROS1執行主動去甲基化，確定了IDM1復合物起始的植物中DNA主動去甲基化的完整調控途徑［30］（圖2）。

2.2 ROS1去甲基化水平的調控機制

ROS1的甲基化敏感性表達是保守的，通過調節轉錄水平響應甲基化水平的改變，從而影響表觀基因組穩定性［31］。目前，在ROS1基因啟動子中發現了可以感知DNA甲基化和去甲基化活性的39 bp的DNA甲基化監測序列（MEMS），其通過調節ROS1表達動態調控基因組DNA甲基化水平［32］（圖3）。MEMS區域的DNA甲基化水平受到ROS1介導的主動去甲基化和RdDM（RNA-directed DNA methylation）途徑介導的從頭合成甲基化動態調控的嚴格控制，研究發現當RdDM轉錄水平高或者去甲基化水平低時，MEMS的甲基化水平增加從而促進ROS1的活性；當RdDm轉錄水平低或者去甲基化水平高時，MEMS的甲基化水平降低從而抑制ROS1的活性［32］。SUVHs可以與MEMS區域結合，結合程度與MEMS的甲基化水平有關，已有研究證明幾個Su（var）3-9同源體（SUVHs）可以檢測MEMS區域的DNA甲基化水平，并冗余地促進ROS1的表達［33］。

SUVH家族蛋白和DnaJ結構域蛋白對于調控ROS1啟動子中的DNA甲基化水平和激活ROS1轉錄也很重要［34-35］。通過分析擬南芥全基因組DNA甲基化，發現許多啟動子甲基化的基因并沒有被沉默，說明除了DNA主動去甲基化，還有另外一種機制可以在不改變DNA甲基化的條件下抵消DNA甲基化和轉錄沉默，SUVH1（Su（var）3-9同源體）就是這樣一種抗沉默因子，在全基因組水平上與高甲基化位點結合，從而直接促進啟動子甲基化基因的表達［36］。SUVH1與同源物SUVH3具有冗余功能，有3個與SUVH1或SUVH3相互作用的DNAJ結構域蛋白（SDJ1、SDJ2和SDJ3），這些蛋白形成緊密蛋白質復合物（SUVH-SDJ）共定位在大量的甲基化的啟動子中，具有轉錄激活活性，從而抑制基因沉默，對于植物的生長和發育至關重要［34］。

細胞溶質鐵-硫簇聚集途徑（Cytosolic ironsulfur cluster assembly，CIA）靶向復合物將Fe-S簇組裝成其結合蛋白，CIA1、AE7和MET18是組成細胞溶質Fe-S簇的裝配因子，在該復合物中，NAR1與Fe-S簇結合，CIA1是一個蛋白質相互作用的支架，圖譜克隆將抗沉默（ASI）因子ASI3鑒定為MET18（圖3）。在細胞質中，CIA途徑組分MET18直接與ROS1相互作用將Fe-S簇轉移至ROS1，從而使ROS1進入核內，通過MEMS檢測甲基化水平動態執行去甲基化功能［37-38］（圖3）。研究發現MET18突變導致數千個基因組位點超甲基化，其中大多數與ros1和ros1dml2dml3突變體中鑒定的高甲基化位點重疊，說明MET18可能在去甲基化途徑中與ROS1一起發揮作用。

圖3 通過胞質鐵硫團簇組裝（CIA）途徑和DNA甲基化調控ROS1［39］

DNA甲基化和DNA去甲基化動態調控ROS1的表達。有研究顯示DNA修復因子——DNA損傷結合蛋白 2（DNA damage-binding protein 2，DDB2）通過與RdDM途徑的調控因子AGO4相互作用來控制從頭合成的DNA甲基化［40］，它刺激甲基化和抑制去甲基化，且能作為ROS1表達的轉錄抑制因子，從而調節其DNA甲基化水平。據報道，DNA甲基化變化引起的ROS1上調可以導致DDB2功能障礙［41］。DDB2還直接與2個下游DNA去甲基化因子ZDP和APE1L相互作用，并刺激它們的活性［42］。總之，DDB2通過對堿基切除修復途徑中上游ROS1和下游ZDP和APE1L的影響在一定程度上調控去甲基化酶ROS1的去甲基化水平。

3 植物體中ROS1主動去甲基化的生物學功能

ROS1生物學功能的探究可以進一步全面了解其生物學功能，對于深入探索去甲基化酶ROS1主動去甲基化具有重要意義。許多研究證明，去甲基化酶ROS1調節多種植物的各類生物學過程（表1）。本文討論了去甲基化酶ROS1在植物中對印記基因表達及調節種子休眠、調控水稻籽粒品質、氣孔發育、病原體防御、鹽協迫耐受等方面的作用。

3.1 ROS1負調控印記基因表達和種子休眠

基因組印記是一種表觀遺傳調控形式，導致母系或父系遺傳等位基因的親本差異表達，胚乳是基因印記的主要場所［43］。已經鑒定出一些植物母系印記基因，如 FWA［44］、MEA［45］、NUWA［46］等。在去甲基化過程中，ZDP、APE1L雙突變和AtLIGI突變可導致MEA和FWA被沉默，進而引起早期種子敗育，母系致死［17，26］。在水稻4種ROS1同源物之一ROS1a中，母體ROS1a的突變會導致胚乳發育停滯和植物發育不足［47］。

DOGL4是調控種子休眠基因DOG1的同源基因［48］，它是一個胚乳中父本不完全印記基因［49］。在ros1突變體中，DOGL4父本等位基因的表達被完全抑制，而母本等位基因的啟動子區域仍保持較低的甲基化水平，從而最終使DOGL4在ros1突變體中變成一個完全的父本印記基因［50］。與母本等位基因相比，DOGL4的父本等位基因由RNA介導的DNA甲基化（RdDM）導致其啟動子的-1.0 kb區域甲基化更高從而使父本等位基因表達受到了部分抑制，即ROS1通過對父本等位基因啟動子進行去甲基化來負調控DOGL4基因的印記。DOGL4參與負調控種子休眠，并且它在胚乳中的印記表達也對種子休眠和ABA響應的調控起一定的貢獻作用，ROS1通過調節DOGL4啟動子區域的去甲基化水平正調控DOGL4的表達，且與野生型相比，ros1突變體種子休眠和ABA敏感性增加［50］。

脫落酸（ABA）是一種植物激素，在擬南芥中，ros1突變體在幼苗發育早期和根生長過程中對ABA高度敏感，在該突變體中發現一些ABA誘導基因的表達水平降低，超過60%的近端區域高度甲基化，說明ROS1介導的DNA主動去甲基化可以調控ABA誘導基因［51］。煙酰胺酶 3（NIC3）在 NAD+補救合成途徑中編碼一種將煙酰胺轉化為煙酸的酶，對ABA反應敏感，在NIC3突變體中需要ROS1介導的DNA主動去甲基化在啟動子上作為轉錄激活［51］。

3.2 ROS1同源基因OsROS1調控水稻籽粒品質

淀粉質胚乳主要儲存淀粉和糊粉，含有豐富的蛋白質、維生素和礦物質［52-53］。三倍體谷物胚乳由外糊粉質胚乳和內淀粉質胚乳組成，是人類不可或缺的主食種類［54］。近期，通過創建并利用半粒種子篩選體系篩檢了近3萬粒水稻種子，獲得一個糊粉層增厚的水稻品系ta2，通過基因克隆發現DNA去甲基化酶基因OsROS1顯性負突變導致糊粉層增厚，從野生型水稻的一層細胞增加到4-10層，對于拓廣禾本科作物營養品質育種具有重要意義［55］。為了提高水稻的營養價值，用正向遺傳方法篩選了糊粉蛋白增厚的突變體，除淀粉外，所有測定的營養因子（包括脂類、蛋白質、維生素、礦物質和膳食纖維）的含量在突變體中均有所增加，該突變體具有豐富的營養因子含量，調控OsROS1對于改善水稻育種中的谷物營養有重要意義［55-56］。

3.3 對植物氣孔發育的影響

ROS1介導的DNA去甲基化在轉基因、轉座因子和一些內源基因的調控中起關鍵作用。然而，在ros1突變體植物中沒有關于明確發育表型的報道。控制氣孔譜系細胞群的表皮作用因子2（EPF2）屬于植物特定的富含半胱氨酸的肽家族，作為氣孔形成的負調節物［57-58］。有研究發現，在ros1突變體中，EPF2的啟動子區域是高甲基化的，這大大降低了EPF2的表達從而導致氣孔增加。去甲基化酶ROS1引發的DNA主動去甲基化在控制植物發育過程中分散的氣孔譜系細胞中起作用［59］。

表1 已知DNA去甲基化酶ROS1在植物發育中的功能

3.4 ROS1對病原體防御起作用

研究表明DNA去甲基化在病原體防御中起著不可或缺的作用［60-61］。ros1突變體顯示對丁香假單胞菌的易感性增加，這與插入抗病基因啟動子的轉座子胞嘧啶甲基化升高相一致，該啟動子抑制了ros1的表達［61］。利用擬南芥-鐮刀形鐮刀形孢菌的病理系統，與野生型（WT）植物相比，三重DNA去甲基酶突變體rdd（ros1 dml2 dml3）對這種真菌病原體高度敏感［8］。以上表明DNA去甲基化在細菌和真菌的抗病性中發揮作用。通過對rdd下調基因的組織特異性和致病誘導表達模式研究，結果表明，在擬南芥中的DNA去甲基化（主要由ROS1完成）可以促進防御相關基因的表達［62］。

3.5 在煙草中ROS1過表達對鹽脅迫耐受

鹽脅迫影響植物的許多生理、生物化學、細胞和分子過程［63］。在植物中，黃酮類和抗氧化途徑的酶對于防御鹽脅迫的影響有關鍵作用［64］。在鹽脅迫條件下，編碼黃酮類和抗氧化途徑酶的各種基因的表達增強［65］。研究發現過表達AtROS1增加了類黃酮生物合成途徑相關基因和抗氧化途徑相關基因的去甲基化水平。在鹽脅迫條件下，過表達AtROS1的轉基因煙草，這些基因啟動子及編碼區域的甲基化水平降低，表現出對鹽脅迫的耐受性［66］。

4 總結與展望

目前，植物中DNA主動去甲基化有了很多研究進展，ROS1是一種重要的DNA主動去甲基化酶，已經對其糖基化酶的功能和酶活性調節的機制有一定的了解，但仍不全面。ROS1主動去甲基化途徑的底端切除修復途徑比較明確，ROS1的招募機制也已經提出，但仍未發現DNA聚合酶的相關信息，下游是如何識別并添加未甲基化的胞嘧啶等問題也有待研究。研究表明DME和ROS1在體外具有顯著的5hmC切除活性，然而在擬南芥中沒有檢測到5hmC，說明植物不太可能利用5hmC作為DNA去甲基化的中介，這表明了在植物中DNA去甲基化的替代途徑的可能性［67］。已顯示生長素在擬南芥中的APOLO基因座處觸發DNA主動去甲基化［68］。然而，我們并不知曉在APOLO基因座上連接生長素與活性DNA去甲基化的媒介。植物中是否還存在其他家族的去甲基化酶，是否還有其他的去甲基化途徑，都是很有意義的研究方向。

目前，ROS1對植物生長發育影響的研究并不多，對于基因表達的調控、表型的改變、果實成熟等方面的作用仍不清晰，所以ROS1介導的DNA主動去甲基化在植物發育中的影響機制或許會有新的發現。在園藝作物中，番茄sldml2突變體有可能產生具有表觀遺傳變異的育種材料，從而導致抑制番茄果實成熟等多種性狀，因此，利用CRISPR技術選擇源自DNA甲基化/去甲基化突變體的等位基因或產生等位基因作為編輯位點進行基因編輯，獲得突變系，可能成為植物育種的重要方法［70］。可以應用CRISPR/Cas9基因編輯技術在不同物種中檢測ROS1在不同生物學過程中的作用，進一步了解ROS1的功能機制及在育種方面的作用。