EGCG對體外培養宮頸癌 HeLa 細胞增殖、凋亡和遷移的影響①

張 燕，邢天容，吳英杰，宋繼榮

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

綠茶中含有的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)單體，不僅含量高，且有著較強的活性[1]。但目前，在宮頸癌中，關于EGCG報道較少，本文特對EGCG對體外培養宮頸癌 HeLa 細胞增殖、凋亡和遷移的影響進行探討，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物試劑和儀器

選擇美國Sigma公司碘化丙啶(PI)、EGCG、噻唑喃(MTT)；美國Costar公司Transwell小室；美國Santa Cruz公司VEGF鼠抗人單克隆抗體；美國Bio-Rad公司Mod550型全自動酶標儀；美國Coulter公司Epics Elite ESP型細胞儀。

1.2 細胞增殖檢查

采取CCK-8法對細胞增殖進行檢測，選擇臨床醫學研究所體外培養宮頸癌HeLa 細胞株，用小牛血清10%將其培養在RPMI1640培養基中，溫度保持在37℃，飽和濕度保持在5%CO2，每間隔2～3d需使用胰酶0.25%進行消化，傳代為1:2，選擇指數生長期中的HeLa 細胞，接種孔板規格為1×104個/mL的96孔板，原培養液需在24h吸出，并在RPMI 1640中加入0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、160mg/L EGCG，復孔每組可設置5個，分別培養14h、48h、72h再將清液吸出，將10uL MTT試劑分為5mg/mL注入到每個孔中，2h后再將清液吸出，加入二甲基亞砜150μL，作用時間為30min，將波長調整為750nm，對吸光度A值進行讀取。

1.3 細胞周期、凋亡檢測

各組細胞在處理48h后，收集0mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L EGCG，PBS 0.01mol/L，重懸細胞5mL，1mL乙醇(70%)，在-20℃條件下將其固定24h，在加入50μL/mL濃度的PI和0.25mg/mL濃度的RNA酶，將室溫調整到適宜狀態，于陰涼處孵育30min，DNA可通過流式細胞儀對其進行分析，再通過ModFit LT對各時細胞百分比進行計算。

1.4 細胞遷移檢測

細胞接種24h后，將培養板中培養液去除，培養孔底部使用移液槍頭10μL劃一條劃痕，通過無血清培養液對其進行洗滌，在注入胎牛血清1%后在培養24h，后在將培養液更換為胎牛血清10%在繼續培養24h，劃痕區遷移情況可通過顯微鏡仔細觀察。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 EGCG對體外培養宮頸癌 HeLa 細胞增殖作用

在以上結果基礎上，對通過EGCG對HeLa 細胞分別進行24h、48h、72h體外培養發現，EGCG可抑制細胞增殖，不同時間和劑量其依賴關系也不同，24h對應的半數抑制濃度IC50為130.2mg/L,48h對應的半數抑制濃度IC50為33.4mg/L,72h對應的半數抑制濃度IC50為21.7mg/L。

2.2 EGCG對體外培養宮頸癌 HeLa 細胞凋亡、遷移的影響

通過對以上篩選結果進行分析，處理48h后，分別對0mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L EGCG對HeLa細胞凋亡、遷移進行分析，結果顯示，細胞凋亡率在未經藥物處理時相對較低，隨著EGCG濃度增加，細胞凋亡率也隨之升高；細胞周期分析結果顯示，EGCG會致使G1期細胞增加，降低S期細胞比例，EGCG濃度越高，其影響越明顯，見表1。

表1 EGCG對體外培養宮頸癌 HeLa 細胞凋亡、遷移的影響

3 討論

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，據相關資料統計，每年約有18萬人次，在世界總發病中占到1/3比例[2，3 ]，位居全球惡性腫瘤發病率中第2名，其病死率排名第4，每年全球約有25萬人因宮頸癌死亡，發展中國家發病率和病死明顯高于發達國家，均位居第2名。且近年來發病率呈不斷上升趨勢，并逐漸向年輕化發展，嚴重威脅女性身體健康。腫瘤轉移和復發是致使宮頸癌患者死亡的主要因素。在目前臨床治療時，關于宮頸癌多采取放療、化療、手術等手段進行治療，但手術治療風險相對較大，易出現盆腔、泌尿系統感染、淋巴囊腫、術后出血等。通過化療、放療雖能對腫瘤細胞轉移、增殖產生一定的抑制作用，但使用傳統藥物具有極強的毒性，且長期使用會使腫瘤產生一定的耐藥性，加之，放療和化療對患者腎臟會產生一定損傷，出現骨髓抑制情況，因此，治療效果有限[4]。關于腫瘤藥物中，具有有效的細胞增殖抑制作用，促進腫瘤細胞凋亡，阻止繼續遷移作用的藥物，成為國內外臨床研究一大熱點。綠茶是一種健康的飲料，經研究發現，綠茶中所含物質具有抗腫瘤作用，如表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)均屬于綠茶中主要成分，具有抗衰老、抗氧化、清除自由基和防止紫外線作用[5，6]。相較于其他單體， EGCG不僅含量最高，且藥理活性極強，抗氧化、降血壓、降血糖、降脂、抗腫瘤作用更為顯著，在心血管疾病中有著良好的預防效果，在肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、結腸癌等方面均有一定殺傷作用[6，7]。由于人體多細胞機體內環境主要依靠細胞凋亡進行維持和自我調節，細胞凋亡、細胞增殖之間相互處于平衡狀態，才能保持人體內環境穩定[8]，因此，在腫瘤治療中，細胞凋亡、細胞增殖同樣具有重要意義。其中細胞凋亡屬于細胞死亡的一種過程，具有多基因調控、程序化特征，促進患者細胞凋亡可達到腫瘤治療目的，因此，在抗腫瘤治療中，細胞凋亡已成為研究重點[9～10]。EGCG能抑制人體中腫瘤細胞增殖，并促進腫瘤細胞凋亡。研究表明，在10～100μg/mL 濃度范圍內，EGCG對宮頸癌患者體內HeLa細胞具有明顯的抑制作用。其依賴時間與EGCG計量有著直接關系。通過顯微鏡和流式細胞儀可觀察檢測到凋亡細胞的形態，發現EGCG進入患者體內48h后會誘導HeLa細胞凋亡,藥物濃度越高，HeLa細胞凋亡率也會隨之上升[11，12 ]。另外，在細胞凋亡過程中，Caspase家族激活具有重要作用，是導致腫瘤細胞凋亡直接因素。目前，臨床研究中發現的Caspase家族已達到10余種以上，包括在細胞凋亡中起關鍵作用的Caspase-3。本研究通過對宮頸癌 HeLa 細胞進行體外培養，并采取MTT法對其檢測發現，EGCG可對細胞增殖產生明顯的抑制作用，且時間和劑量不同，其抑制效果表現也不一，DNA倍體通過流式細胞儀進行分析得出，EGCG作用48h，10mg/L、20mg/L、40mg/L濃度不斷加大，S期細胞減少情況表現越明顯，細胞周期阻滯效果明顯優于G1期。由于腫瘤細胞還具有轉移和浸潤性特征，通過細胞劃痕法進行檢驗發現，EGCG對細胞轉移同樣具有抑制作用，經過EGCG作用后，在劃痕區腫瘤細胞基底膜穿過能力明顯下降，且數量出現減少情況。