Klotho蛋白在UUO大鼠腎組織中的表達(dá)①

聶 晶，梅 梅，楊占雙，楊 松

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

腎臟纖維化(RIF)是一種病理生理改變，是腎臟的功能由健康到損傷，再到損壞，直至功能喪失的漸進(jìn)過(guò)程，病理特點(diǎn)是以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常沉積。根據(jù)腎臟固有細(xì)胞受損害程度，以及是否還可以被修復(fù)，將腎臟纖維化的過(guò)程分為纖維化形成與進(jìn)展的可逆階段和瘢痕形成階段，目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究集中在第一階段。研究表明，在多種因素(藥物中毒、高血壓、糖尿病、慢性腎病等)作用下，腎臟固有細(xì)胞受到損傷發(fā)生功能改變，釋放一系列致腎毒性的細(xì)胞因子，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，其中TGF-β1∕Smad3作為至纖維化的共同通路，在RIF中發(fā)揮重要作用[1]。Klotho是TGF-β1∕Smad3通路的上游基因，與衰老有關(guān)。Klotho蛋白在腎遠(yuǎn)端小管中高表達(dá)[2]。有研究顯示，klotho蛋白參與腎間質(zhì)纖維化[3]，但具體作用機(jī)制不詳盡。因此，本研究通過(guò)建立大鼠腎臟纖維化模型，觀察病變腎組織中Klotho蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步明確其至RIF的機(jī)制，可能為尋求延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物

兔抗大鼠Klotho多克隆抗體，MASSON染色試劑盒，DAB試劑盒， SABC免疫組化試劑盒。健康清潔Wistar 42d齡雄性大鼠48只(由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制作

將48只Wistar雄性大鼠飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為兩組，即正常組24只，UUO組24只。UUO組在無(wú)菌條件下行左側(cè)輸尿管結(jié)扎：術(shù)前稱重，以10%水合氯醛0.4mL/100g腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒，逐層進(jìn)腹后，暴露腎臟，游離輸尿管，在其近端及遠(yuǎn)端結(jié)扎，中間離斷，頭孢甲肟生理鹽水腹腔沖洗，確保無(wú)出血及漏尿后逐層縫合。正常組僅做輸尿管游離，不結(jié)扎。

1.2.2 標(biāo)本收集、整理和測(cè)定

各組大鼠分別于術(shù)后第 3d、7d、14d處死，處死前內(nèi)眥靜脈采血3mL，離心后行血尿素氮和肌酐檢測(cè)，處死后留取左腎組織，常規(guī)進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切邊(3μm厚)，行HE染色，MASSON染色和免疫組化染色。

1.2.3 HE染色和MASSON染色

石蠟切片進(jìn)行HE染色和MASSON染色，觀察腎小管間質(zhì)損傷情況和腎纖維化程度。HE染色在400倍光鏡下，觀察腎間質(zhì)炎性細(xì)胞變化。MASSON染色，參考文獻(xiàn)[4],在400倍光鏡下，每張標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)不含腎小球的視野以綠染纖維(即陽(yáng)性面積)與整個(gè)視野總面積的比值作為腎間質(zhì)纖維化指數(shù)(RIF)。

1.2.4 免疫組化染色

石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，在400倍光鏡下觀察klotho蛋白表達(dá)情況，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，分析計(jì)算兩組腎組織陽(yáng)性染色(棕黃色顆粒)的平均光密度(IOD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血BUN及Cr分析

正常組3d、7d、14d血BUN、Scr未見(jiàn)明顯異常與正常組相比，UUO組個(gè)時(shí)間點(diǎn)血 BUN、Scr明顯升高，且隨著梗阻時(shí)間逐漸加重。

2.2 HE染色結(jié)果分析

正常組的各時(shí)間點(diǎn)腎臟病理未見(jiàn)改變，UUO組隨著時(shí)間的推移，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增多，受累腎小管出現(xiàn)先擴(kuò)張，至第7天擴(kuò)張明顯，后逐漸萎縮，腎組織出現(xiàn)纖維化。見(jiàn)圖1～4。

圖1 正常組腎組織(HE×400)

圖2 UUO組第3天腎組織(HE×400)

圖3 UUO組第7天腎組織(HE×400)

圖4 UUO組第14天腎組織(HE×400)

2.3 MOSSON染色分析

Masson 染色顯示對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)腎臟病理結(jié)構(gòu)未見(jiàn)改變，UUO組隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，壞死程度逐漸加重，綠染的面積增大，RIF指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腎組織MOSSON染色RIF值

2.4 Klotho蛋白免疫組化分析

正常組各時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)一定量的棕黃色顆粒；與對(duì)照組相比，UUO組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腎組織中棕黃色顆粒減少，且隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，棕黃色顆粒減少越明顯，梗阻14d的腎組織細(xì)胞質(zhì)中幾乎無(wú)棕黃色顆粒表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)，證明在正常大鼠腎組織中有Klotho蛋白表達(dá)，隨著腎間質(zhì)纖維化程度的加重，Klotho表達(dá)逐漸減少。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎組織Klotho蛋白表達(dá)情況

3 討論

Klotho蛋白作為單向跨膜蛋白，具有調(diào)節(jié)鈣磷作用，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和衰老等[5]；主要在腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)，可在血液及尿液中檢查到。近年來(lái)相繼有研究報(bào)道，Klotho在多種急、慢性腎臟疾病中發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，Klotho蛋白是通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，減輕腎間質(zhì)纖維化。如果Klotho基因的缺乏將導(dǎo)致腎臟更容易受到缺氧及藥物所致的損傷[7，8]。近年來(lái)，有學(xué)者研究表明，Klotho蛋白可以抑制TGF-β1通路誘導(dǎo)的UUO大鼠腎臟纖維化[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立UUO大鼠模型，分析Sham組、UUO兩組大鼠Klotho蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，UUO組大鼠隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)出Klotho蛋白的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，腎間質(zhì)纖維化程度亦逐漸加重，Sham組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Klotho蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯改變，因此經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究論證Klotho蛋白在腎臟纖維化中發(fā)揮重要的功能保護(hù)作用。研究[10]表明：慢性腎臟病(CKD) 早期，血清中 Klotho 蛋白的水平便開(kāi)始下降，與GFR的下降趨勢(shì)呈正比，這種變化顯然先于血肌酐、血尿素氮等指標(biāo)的變化，并具有一定特異性。李莎莎[11]等通過(guò)對(duì) 130 例 CKD 患者隨訪發(fā)現(xiàn)腎功能顯著降低的患者，可表現(xiàn)出Klotho水平大幅度下降，提示Klotho蛋白水平隨腎功能的降低而下降。因此，Klotho蛋白不僅在腎臟保護(hù)方面發(fā)揮重要作用，還有望成為有CKD早期診斷的生物標(biāo)志物。