血漿外泌體源性lncRNAH19和lncRNAMALAT1與膀胱癌的相關性研究①

王 彤，李 升，黃立娟

(1.佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003;2.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150081)

膀胱癌(BC)是全球最常見的惡性腫瘤之一。當前，尿液細胞學檢查缺乏排除癌癥所必需的診斷敏感性，膀胱鏡病理活檢是診斷膀胱癌的金標準，但具有侵入性且價格昂貴，患者接受度低。 因此，需要新的標記物來幫助無創檢測和監測膀胱癌[1，2]。外泌體是一種小的膜性囊泡，在腫瘤的發生發展過程中起著重要的作用，且由于外泌體含量相對穩定，研究已經應用于基因治療。 因此，尋找外泌體中的標志物可以提高對于膀胱癌的早期篩查、早期診斷和早期治療。有證據表明，lncRNA通過表觀遺傳調控、DNA損傷和細胞周期調控、對microRNA的調控[3，4]參與信號轉導通路和介導激素等方式參與腫瘤的發生和發展。有報道顯示，很多異常的lncRNA可以成為癌癥診斷和預后的潛在生物標志物。本研究通過qRT-PCR分析lncRNAH19和 lncRNAMALAT1在外泌體中的表達水平，探討其與膀胱癌患者臨床病理參數的相關性及其對于膀胱癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017-10～2019-05在哈爾濱醫科大學附屬第二醫院首次確診50例膀胱癌患者標本及50例健康對照組標本。標本采集須符合以下標準：(1)膀胱癌患者組采集靜脈血前均未經手術、放療及化療等任何處理，且除膀胱癌外無其他類型腫瘤存在。(2)同時收集健康體檢者血樣50例，健康體檢者查體顯示無任何腫瘤相關疾病。(3)臨床資料齊全。所有樣本采集前均經哈爾濱醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準，獲得患者同意并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

EDTA抗凝管采集兩組研究對象的靜脈血，分別編號予以區別。4℃，3000g離心15min，上層的透明黃色液體即為血漿，利用超速離心法提取外泌體。利用外泌體RNA提取試劑盒(Exosome RNA Extraction Kit)提取總RNA，用電腦NanoDrop3330分光光度計對RNA進行檢測，檢測其濃度。用MonScript RTIII All-in-One Mix將RNA反轉錄為cDNA；lncRNAH19的上游引物：ACTCCAGAGCAAGCGTGTCATTC,下游引物：CTGCCTGGGGAGGGACACATG，lncRNAMALAT1上游引物：GACTACAGAGCCCCGAATTAATAC，下游引物：CATTTTCGTCTGCGTTTAGTAAATG,β-actin上游引物：ACCGAGCGCGGCTACAG：，下游引物： CTTAATGTCACGCACGATTTCC。引物均由上海生物科技有限公司合成。實時熒光定量PCR檢測，設置為95℃30s,95℃10s,60℃30s,40個循環。lncRNAH19、lncRNAMALAT1均以β-actin為內參，用計算lncRNAH19、lncRNAMALAT1的相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS25.0統計軟件分析，兩組比較采用獨立樣本t檢驗;定量數據采用四中位數[M(P25,P75)]，將膀胱癌血漿外泌體lncRNAH19和lncRNAMALAT1的相對表達量與相應的臨床病理參數進行統計分析；ROC受試者工作特征曲線評價lncRNAH19、lncRNAMALAT1對于膀胱癌的診斷價值。

2 結果

2.1 血漿外泌體中lncRNAH19、MALAT1的表達水平

lncRNAH19、MALAT1在膀胱癌組外泌體中的表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2 血漿外泌體lncRNAH19、MALAT1的表達水平與臨床病理參數的相關性

lncRNAH19、MALAT1在外泌體中的表達與其臨床病理參數無明顯相關性(P>0.05)。見表2。

2.3 血漿外泌體中lncRNAH19、MALAT1對膀胱癌的診斷價值

ROC曲線分析評估lncRNAH19、MALAT1對膀胱癌的診斷價值：lncRNAH19、MALAT1的曲線下面積(AUC)分別為0.971，0.878，lncRNAH19特異性為72%，敏感度為98%；lncRNAMALAT1特異性為84%，敏感度為92%。lncRNAH19、lncRNAMALAT1聯合診斷的曲線下面積(AUC)為0.994，特異性為94%，敏感度為96%。見表3，圖1。

表1 血漿外泌體中lncRNAH19、MALAT1的表達水平

表2 膀胱癌患者血漿外泌體LncRNAMALAT1的表達水平與臨床病理參數的相關性

表3 lncRNAH19、lncRNAMALAT1作為生物標志物對于膀胱癌的聯合診斷價值

圖1 血漿外泌體lncRNAH19與lncRNAMALAT1聯合ROC受試者工作曲線

3 討論

膀胱癌(BC)作為全世界泌尿系統最常見的惡性腫瘤[5]，其復發率很高。據報道，lncrna與膀胱癌的發生發展密切相關。研究表明，許多異常的lncRNA可以成為新的非侵襲性的生物標志物，用于不同腫瘤的診斷和預后。來自外泌體的lncRNA已在多種體液中被檢測到。雖然核糖核酸酶存在于血液中，但由于外泌體和微泡的保護，lncRNA仍然是穩定的。因此，來自外泌體的lncRNA具有良好的腫瘤診斷前景。本研究初步探討了膀胱癌患者血漿外泌體中lncRNAH19、lncRNAMALAT1的表達水平及其對于膀胱癌的診斷價值，為膀胱癌的診斷提供理論依據。

長期以來，人們一直認為膀胱癌中的lncRNAH19表達可用作早期復發的預后標志物[6，7]。Liu等人證實lncRNAH19的mir-675通過誘導G1阻滯和抑制細胞凋亡來促進膀胱癌細胞的增殖，這可能與mir-675對抑癌基因p53[8]的負調控有關。此外，最近的研究表明，lncRNAH19是從多種癌癥中釋放出來的，并且在患者的血清中可以作為一種穩定的形式被檢測到，這種形式可以防止內源性RNase的侵襲。已經證實lncRNAMALAT1在膀胱癌中的表達較鄰近正常組織表達上調，并在轉移后較無轉移的原發腫瘤有明顯升高。因此，循環血中的lncRNAH19、lncRNAMALAT1有希望成為新的生物標志物[9]，用于癌癥的早期檢測或預后。

本研究通過qRT-PCR比較lncRNAH19、lncRNAMALAT1在膀胱癌組和健康對照組中的表達水平。結果發現，lncRNAH19、lncRNAMALAT1在膀胱癌患者中的表達水平明顯高于健康對照組[10](P<0.05)，此外，我們還評估了兩種lncRNA的表達水平與其臨床病理參數的相關性，發現并無統計學意義(P>0.05)。最后我們繪制了ROC曲線，用來評價兩種lncRNA分子對于診斷膀胱癌的敏感度和特異性：lncRNAH19、lncRNAMALAT1的曲線下面積(AUC)分別為0.971，0.878，lncRNAH19特異性為72%，敏感度為98%；lncRNAMALAT1特異性為84%，敏感度為92%。lncRNAH19、lncRNAMALAT1聯合診斷[11]的曲線下面積(AUC)為0.994，特異性為94%，敏感度為96%。這些研究都為體液研究成為診斷膀胱癌的方式開辟了新的途徑。

但我們的研究仍然存在一定的局限性，樣本量相對有限，且由于時間限制，科研經費短缺及設備緊張，有些實驗仍未進行。本研究只選擇了健康對照組，并未加入良性病變組，若要應用于臨床還需要擴大樣本數量，不排除其他未知因素對膀胱癌診斷的特異性和診斷性的影響,還需要進一步擴大研究對象進行研究。