三陽性與三陰性乳腺癌中ERβ亞型的表達①

譚 添，李義強

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

乳腺癌作為最常發生于女性的惡性腫瘤，迄今為止其死亡率隨著發病率的升高反而下降，這與我們針對不同乳腺癌患者的個體化治療密切相關。乳腺癌作為雌激素依賴性腫瘤，有效的內分泌治療為其良好的預后發揮了舉足輕重的作用。據報道，即使ER不表達的部分乳腺癌依然對內分泌治療敏感，相反，ER表達的乳腺癌一部分卻無法在內分泌治療中得到緩解。根據乳腺癌分子分型我們可知，有兩種類型的乳腺癌似乎無法從傳統的內分泌治療中受益，它們分別為三陽性乳腺癌(ER、PR、Her-2受體均為陽性)與三陰性乳腺癌(ER、PR、Her-2受體均為陰性)。如今，我們希望通過系列研究去填補二者的治療空缺。據相關研究證實，在雌激素家族受體中，除了大家熟知的ERα受體，還有一部分ERβ受體的表達情況與乳腺癌的預后及內分泌治療也存在一定聯系，盡管有相關文獻記載，但對于ERβ的作用還未曾形成定論[1]。

ERβ受體最早發現于老鼠的前列腺和卵巢中[2]， ERβ及其亞型在雌激素信號轉導及雌激素依賴性腫瘤的發生發展過程中起到關鍵性作用[3]。目前，對于內分泌治療不敏感的三陽性及三陰性乳腺癌來說，ERβ在它們中的表達情況、與二者臨床病理和預后的關系，以及ERβ能否作為除ERα外另一個對內分泌治療敏感的因子治療三陽性乳腺癌和三陰性乳腺癌，都值得我們期待。

1 材料和方法

1.1 材料

收集佳木斯大學附屬第一醫院2013-06～2019-05，術前未行任何治療并于我院行改良根治術的原發性單側乳腺癌組織病理蠟塊標本，三陽性乳腺癌72例，三陰乳腺癌58例。納入標準為：① 經慢速病理回報確診者；② 女性患者；③ 免疫組化及病理資料完整者。排除標準：COX風險回歸中未取得復發時間的患者資料。

1.2 檢測方法

將福爾馬林液固定、石蠟包埋的癌組織進行5μm連續切片，然后對標本進行脫蠟及水化，置于免疫組化抗原修復緩沖液中，后滴加內源性過氧化物酶阻斷劑孵育10min再用PBS緩沖液進行沖洗(3min/次，共3次)。滴加一抗(兔來源，購自維百奧(北京)生物科技有限公司)，后行孵育及PBS緩沖液沖洗，加入二抗(兔來源，購自北京中杉金橋生物技術有限公司)再行孵育及沖洗，隨后加入配置的DAB顯色液室溫孵育8min，最后經蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

1.3 評價標準

在癌組織中對ERβ行免疫組化染色后，隨機選擇5個高倍視野進行評分。染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1 分，黃色為2分，棕褐色為3分。單位鏡下ERβ陽細胞所占比率評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數目所占比例1%～25%為1分，陽性細胞數目所占比例26%～50%為2分，陽性細胞數目所占比例51%～75%為3分，陽性細胞數目所占比例76%～100%為4分。最后總分為癌細胞的染色強度和陽性細胞所占比率兩項評分的總和：若總評分≥3分則判定ERβ表達陽性；﹤3 分為ERβ表達陰性。其次，分別記錄兩種乳腺癌患者的年齡、腫塊大小、組織分級、淋巴結轉移情況、ki-67表達及三年復發情況，并統計。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件分析數值，計數資料組間比較采用四格表χ2檢驗、Fisher’s 精確檢驗。采用COX生存曲線比較兩種乳腺癌組織中ERβ表達與復發的相關性。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三陽性乳腺癌和三陰乳腺癌組織中ERβ蛋白的表達情況

三陽性乳腺癌組織中ERβ蛋白表達陽性52例(72.2%)(圖1)，三陰性乳腺癌組織中ERβ蛋白表達陽性32例(55.2%)(圖2)，兩種乳腺癌組織中ERβ蛋白的陽性表達率差異有統計學意義。見表1。

表1 三陽性乳腺癌和三陰乳腺癌組織中ERβ蛋白的表達情況

圖1 三陽性乳腺癌ERβ陽性表達(免疫組織化學染色 ×200)

圖2 三陰性乳腺癌ERβ陰性表達(免疫組織化學染色 ×200)

2.2 三陽性乳腺癌中ERβ蛋白的表達及與臨床病理的關系

在三陽性乳腺癌中，ERβ蛋白與淋巴結的轉移情況不具有統計學意義(P>0.05)。≤40歲的患者其ERβ蛋白陽性表達率為38.1%，>40歲的患者其陽性表達率為86.3%(P<0.05)；本組中的ERβ蛋白按腫瘤大小的不同≤2cm和>2cm，其陽性表達率分別為94.7%和61.2%(P<0.05)；而分期為Ⅰ、Ⅱ期的ERβ蛋白其陽性表達率為84.8%，高于Ⅲ期ERβ蛋白的50.0%(P<0.05)；在病理學分級為Ⅰ級+Ⅱ級和Ⅲ級組中的陽性表達率分別為80.8%和50.0%(P<0.05)；三陽性乳腺癌中ki-67高表達組與低表達組中的ERβ蛋白表達率分別為57.9%、88.2%(P<0.05)。見表2。

表2 三陽性乳腺癌中ERβ蛋白的表達及與臨床病理間的關系

2.3 三陰性乳腺癌中ERβ蛋白的表達及與臨床病理的關系

三陰性乳腺癌組織中，ERβ蛋白與患病年齡及淋巴結轉移情況間不具有統計學意義(P>0.05)。本組中ERβ蛋白在腫瘤大小為≤2cm和>2cm組中的陽性表達率分別為85.8%和45.5%(P<0.05)；本組中分期為Ⅰ、Ⅱ期的ERβ蛋白陽性表達率為79.2%，高于Ⅲ期的38.2%(P<0.05)；在病理學分級為Ⅰ級+Ⅱ級和Ⅲ級組中的陽性表達率分別為72.7%和32.0%(P<0.05)；且ki-67高表達組與低表達祖中的ERβ蛋白表達率分別為46.3%、76.5%(P<0.05)。見表3。

2.4 三陽性及三陰性乳腺癌復發COX回歸分析影響因素

采用單因素Cox分析三陽性和三陰性乳腺癌中對于復發有意義的影響因素，結果表明年齡<40歲和ERβ的陰性表達分別為腫瘤復發的獨立影響因素，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4～5。

表3 三陰性乳腺癌中ERβ蛋白的表達及與臨床病理間的關系

表4 三陽性乳腺癌復發Cox回歸分析影響因素

表5 三陰性乳腺癌復發Cox回歸分析影響因素

3 討論

對于三陽性乳腺癌與三陰性乳腺癌的非手術治療及術后輔助治療方式的探究已經引起了醫學界的廣泛重視，因其分子分型表達的特殊性，故目前還未曾出現明確內分泌治療的靶點針對二者進行精準治療。同屬雌激素受體的ERβ雖然在DNA與配體結合區和ERα 高度同源，而在A/B區，D區及F區卻展現了較高的特異性，所以ERβ既帶有某些令人熟知的生物學功能又有著讓人未曾發掘的生物學效應。

3.1 ERβ亞型在三陽性與三陰性乳腺癌中的表達

多項研究表明，在乳腺正常組織、不典型增生及癌組織中，ERβ的表達逐漸降低，部分學者認為ERβ可作為預判乳腺癌預后較好的靶點之一，主要原因可能為ERβ1能抑制Efp蛋白表達，從而影響乳腺癌細胞活性。另外有研究提示ERβ的表達可抑制ERα的表達，故在ERβ表達的乳腺癌中因ERα的被抑制，癌細胞增殖也受到影響。本次試驗中，ERβ在三陽性乳腺癌中的表達明顯高于在預后較差的三陰性乳腺癌中的表達，也間接證實了這一觀點。

3.2 ERβ亞型與臨床病理的關系

本實驗顯示，無論三陽性乳腺癌或是三陰性乳腺癌中，ERβ的表達都與年齡、腫瘤大小、腫瘤分期、腫瘤分級以及ki-67的表達有關，且提示腫瘤惡性程度越低其表達越高，這一結論也與國內一些實驗結果[4]相一致。研究證實，ERβ主要通過三種方式進行信號傳導，分別為以二聚體為基礎的經典途徑、在轉錄因子幫助下進行轉錄的非經典途徑和G蛋白偶聯信號轉導通路，雌激素受體在任何下游通路中表達異常都會影響腫瘤的轉移及復發。有基礎研究顯示，ERβ表達的下降使其失去了對于正常乳腺細胞調控的作用，增加了癌細胞侵襲和轉移的風險。顯然，ERβ的低表達可促使乳腺癌發生發展，雖然納入患者標準及隨訪時間的不同可能會對實驗結果造成一定差別，但本實驗結果依然支持ERβ作為一種保護性因子存在于不同類型的乳腺癌中。

3.3 ERβ亞型與預后及復發

本次實驗三陽性與三陰性3年復發率分別為22.4%和25.9%，年齡與ERβ的表達情況是兩種類型類型乳腺癌獨立的復發影響因素，表明發病年齡較低、ERβ的低表達可預示其不良的預后，這與國內外相關研究得出的結論相符[5,6]。且1～3年為乳腺癌術后復發高峰期也有學者胡一迪等研究的證實。在三陽性與三陰性乳腺癌中，ERβ陽性率較高的組別其3年復發率明顯降低。這也印證了ERβ的高表達能維持乳腺細胞的正常生理功能，抑制乳腺細胞的異常增值，從而限制乳腺癌細胞的轉移能力。對于其分子機制的相關研究證實，經ERβ轉染的乳腺癌細胞可出現明顯G1/S期停滯，甚至誘導凋亡，從而抑制腫瘤生長。目前對于三陰性乳腺癌的內分泌治療研究還在經受發病數量上的限制，故還無法完全明確影響其預后的因素，相關文獻提示ki-67的表達、淋巴結轉移情況以及代謝情況等都會影響其預后[7,8]，故需要擴大樣本量以及增加隨訪時間來進一步探究。

3.4 三陽性及三陰性乳腺癌的內分泌治療

在三陽性乳腺癌中，乳腺癌細胞由HR通路及活化的Her-2蛋白共同介導，二者通路形成交聯網絡[9]。所以當抑制ER通路后，活化的Her-2蛋白依然可以促進細胞的增值，另外，Her-2通路可介導其下游分子激活ER，使ER進行非配體依賴性生長。二者共同導致三陽性乳腺癌對內分泌治療產生耐藥性。目前對于三陽性乳腺癌的輔助治療依然更傾向于曲妥珠單抗與帕托珠單抗的雙靶向治療加芳香化酶抑制劑。但有研究顯示ERβ的高表達可增加他莫昔芬對腫瘤細胞的增殖抑制作用，即降低對內分泌治療的耐藥性,且對于ERα與ERβ共同表達的腫瘤細胞可增加他莫昔芬的反應性。故對于三陽性乳腺癌來說ERβ表達陽性的患者似乎對內分泌治療受益更多，相關研究還在進行，但這卻讓ERβ在內分泌治療領域更受關注。對于三陰性乳腺癌來說，因發病年齡低，預后差，易轉移且對傳統內分泌及靶向治療反應性差，使得這一類患者在治療過程中受到了莫大的限制[10]。部分ERα表達陰性的乳腺癌中還有一部分表達為ERβ陽性，即ERα-/ERβ+，而如今存在大約 10%的ERα陰性患者依然會對內分泌治療敏感。那么，ERβ能否成為新靶點針對部分ERα-/ERβ+的三陰性乳腺癌患者提供更加廣闊的治療手段似乎值得我們期待。

綜上所述，本實驗依然存在諸多不足，例如未徹底排除ERβ其他亞型可能對實驗產生的干擾、未從基因及分子層面進一步研究以及樣本量不足等。針對ERβ在不同類型乳腺癌中的表達及其對內分泌治療產生的影響還需要更多樣本量及不同實驗方法來更深一步的證實。