骨髓單個核細(xì)胞移植對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠miR-155表達的影響①

張 赫，鮑秀琦，韓宇鵬，韓桂華，陳 曦，布 瓊，戚亞男

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154003)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種病因不明的結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病。miR-155是一種內(nèi)源性非編碼小RNA。多個實驗表明miR-155參與免疫細(xì)胞的生殖、分化，并調(diào)控慢性潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展[1]。前期實驗[2]表明骨BM-MNCs移植對小鼠UC模型具有一定的修復(fù)作用。本研究旨通過復(fù)制BM-MNCs移植過程，對腸道組織中miR-155表達的研究以期更清晰認(rèn)識BM-MNCs移植對UC的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物

清潔級 KM 小鼠72只，雄性，重量29～31g。動物合格證號： No. 211002300051893，遼寧長生，許可證號：SCXK(療)2015-0001。

1.2 藥物與試劑

小鼠骨髓淋巴細(xì)胞分離液(天津灝洋)；DSS(美國MP公司)；PBS泡騰片(武漢博士德)；水合氯醛(山東普惠分化學(xué)科技有限公司)；動物組織miRNA提取試劑盒(成都福際)；cDNA第一鏈合成試劑盒(上海羅氏)。

1.3 儀器

PCR熱循環(huán)儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；電泳儀，上海伯樂醫(yī)學(xué)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.4 分組與UC模型制備

72只小鼠隨機取54只，稱重并記錄數(shù)據(jù)，隨機分為三組，分別為：正常對照組、UC模型組和BM-MNCs移植組，每組小鼠18只；余18只小鼠正常喂養(yǎng)用于提取BM-MNCs。正常對照組：常規(guī)喂養(yǎng)不做特殊處理；UC模型組與BM-MNCs移植組：采用2.5%DSS溶液替代飲水自由飲用7d，飼料正常喂養(yǎng)。

1.5 小鼠一般情況的觀察和UC活動指數(shù)評估

采用Steidler等[3]的DAI評分標(biāo)準(zhǔn)每日對實驗動物進行評分。

1.6 骨髓單個核細(xì)胞(BM-MNCs)的提取

健康KM小鼠用10%水合氯醛腹腔注射處死，放入75%酒精浸泡消毒 3min。無菌剝?nèi)‰p側(cè)脛骨、股骨，剪去骨兩端，用小鼠淋巴細(xì)胞沖洗液反復(fù)沖洗骨髓腔至骨髓腔變白，得到骨髓細(xì)胞懸液，余操作嚴(yán)格按試劑說明書逐一進行，全程操作均需在無菌及相同環(huán)境條件下進行，最終得到BM-MNCs。

1.7 BM-MNCs移植

造模成功后12h內(nèi)，將移植組小鼠用固定器固定，暴露尾靜脈，將染色后的BM-MNCs懸液經(jīng)小鼠尾靜脈注入(細(xì)胞含量約為3.2×106個/0.4mL)；UC模型組與正常對照組每只小鼠尾靜脈注入0.4mL PBS。

1.8 組織標(biāo)本處理

移植成功后，同等條件下對三組小鼠全部進行正常喂養(yǎng)，繼續(xù)記錄小鼠的飲水進食、活動情況、精神狀態(tài)、體重及大便性狀。移植成功后第5天，將全部小鼠水合氯醛麻醉處死，取其結(jié)腸組織，PBS沖洗，將結(jié)腸切成1cm每段。移植組隨機取3只小鼠部分新鮮組織做快速冰凍切片(10μm)，電子熒光顯微鏡下觀察BM-MNCs定植情況。4%中性甲醛固定24h，制備蠟塊，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.9 結(jié)腸組織miR-155的檢測

采集新鮮的結(jié)腸組織30mg，經(jīng)液氮冰凍后磨碎勻漿，按試劑說明書操作提取總RNA。分光光度計測定RNA濃度，使用羅氏cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒，PCR儀擴增miR-155， U6為內(nèi)參，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，然后94℃10s、50℃20s、72℃30s，35個循環(huán)，72℃7min、4℃冷卻。采用2^-ΔΔCT法分析比較miR-155在三組間的表達情況。見表1。

表1 引物序列

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠DAI評分

正常對照組小鼠 DAI 評分從始至終都為0分。UC模型組與BM-MNCs移植組在喂養(yǎng)DSS 3d后DAI評分逐漸增加，自移植成功后起，UC模型組DAI評分繼續(xù)升高，而BM-MNCs移植組升高不明顯。移植后第5天BM-MNCs移植組評分較UC模型組明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠DAI評分分)

2.2 各組結(jié)腸組織病理學(xué)光鏡下比較

光學(xué)顯微鏡下觀察病理切片。正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜組織完整，無破潰，無炎癥細(xì)胞浸潤，腺體結(jié)構(gòu)正常。UC模型組結(jié)腸組織可見大量中性粒細(xì)胞浸潤，隱窩組織高度破壞、腺體變形，部分黏膜下層血管擴張；而BM-MNCs移植組炎癥細(xì)胞浸潤相對較少，隱窩組織部分破壞，結(jié)構(gòu)相對完整，炎癥程度有所改善。見圖1。

圖1 正常組、UC模型組、BM-MNCs移植組(×200)

2.3 結(jié)腸組織miR-155表達情況

對各組小鼠結(jié)腸組織進行rT-PCR檢測，結(jié)果顯示，UC模型組明顯高于正常對照組與BM-MNCs移植組，BM-MNCs移植組中miR-155表達略高于正常對照組，而明顯低于UC模型組，見表3。

表3 3組miR-155表達情況比較

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種長期慢性疾病，其重癥UC有預(yù)后差、長期療效不佳、易復(fù)發(fā)等特點，隨著整體生活水平的提高，我國UC的發(fā)病率逐年上升，傳統(tǒng)治療手段已不能滿足現(xiàn)代人的醫(yī)療需求。UC的發(fā)病機制至今未完全明確，現(xiàn)人們認(rèn)為由多種因素相互作用造成的結(jié)果，包括環(huán)境、遺傳、腸道微生物和免疫等因素，部分學(xué)者認(rèn)為腸黏膜由于遺傳、環(huán)境等各種因素導(dǎo)致其免疫系統(tǒng)異常激活是其重要的發(fā)病機制之一[4]。

BM-MNCs是干細(xì)胞成員之一，主要包括內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等混合細(xì)胞成分。其具有很高的增殖能力，多向分化潛能，天然低免疫原性，使其可移植可能性大大增高，外國學(xué)者研究BM-MNCs移植對慢性UC修復(fù)作用具有長期穩(wěn)定的效果[5]。國內(nèi)對骨髓單個細(xì)胞的研究逐漸加深，有實驗表明，BM-MNCs移植能通過下調(diào)COX-2、IL-1β的表達抑制腦梗死后的炎癥反應(yīng)，改善大鼠神經(jīng)功能[6]；也有研究表明BM-MNCs移植能重建小鼠造血系統(tǒng)[7]。近年來，干細(xì)胞移植技術(shù)及修復(fù)方法逐漸發(fā)展，部分學(xué)者已應(yīng)用于臨床試驗，5例UC自體干細(xì)胞移植治療緩解率100%，隨訪3～14個月無復(fù)發(fā)，取得良好療效及長期穩(wěn)定的治療效果[8]，為UC的臨床治療提供依據(jù)。

MicroRNA(miRNA) 是一類長度18～22個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼小RNA。miRNA也可以調(diào)控下游炎癥因子的分泌及釋放，影響機體的免疫系統(tǒng)，參與各種炎癥反應(yīng)[9]。國內(nèi)已有臨床實驗，25例UC患者外周血和直腸黏膜組織中的miR-155均呈高表達，并與疾病的炎癥程度呈正相關(guān)[10]。也有動物實驗表明miR-155過量表達可激活Th17表達，并促進IL-6、IL-17、IL-23等炎癥因子的釋放，從而參與并加重UC的發(fā)生、發(fā)展[11]，均表明miR-155與UC的發(fā)病、進展呈正相關(guān)。Li等[12]的研究發(fā)現(xiàn)miR-155的降低能導(dǎo)致促炎性的巨噬細(xì)胞M1型轉(zhuǎn)換成抗炎細(xì)胞巨噬細(xì)胞M2型，進一步抑制Th17細(xì)胞表達，以減少炎癥因子的表達。

本實驗應(yīng)用DSS喂養(yǎng)建立UC模型，提取并移植BM-MNCs，移植后第5天，移植組較UC組DAI評分明顯降低，取其結(jié)腸組織光學(xué)顯微鏡下見移植組炎癥細(xì)胞較少、破壞程度降低，較UC模型組整體炎癥變輕。應(yīng)用rT-PCR檢測其腸道組織中miR-155的表達，移植組均明顯低于UC模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，證明了BM-MNCs移植能有效的改善UC的炎癥反應(yīng)，通過BM-MNCs移植其miR-155的表達較UC模型組明顯降低，考慮BM-MNCs移植可能通過降低miR-155的表達以減少炎癥的發(fā)生、發(fā)展，為臨床治療提供思路。