胰腺癌患者手術前后外周血淋巴細胞亞群和血小板變化

程 娟，管世鶴，陳禮文，張敬軍，陳淑英

（1.安徽醫科大學第二附屬醫院檢驗科，安徽 合肥 230601；2.復旦大學附屬華山醫院康復醫學科，上海 200040；3.復旦大學附屬華山醫院檢驗醫學科，上海 200040）

胰腺癌是消化道腫瘤中預后較差的惡性腫瘤之一，其發病隱匿，缺乏特異的臨床表現，當患者出現典型臨床癥狀或影像學提示異常時，腫瘤已侵犯胰腺周圍組織器官或發生遠處轉移。胰腺癌患者的5年生存率很低，手術是目前唯一可能治愈胰腺癌的方式[1]。免疫功能和炎癥反應在癌癥的發生、發展和轉移中也發揮重要作用[2]。人體外周血淋巴細胞亞群和血小板（platelet，PLT）水平可反映體內炎癥免疫反應狀態。有研究結果顯示，多種腫瘤患者存在淋巴細胞和PLT水平的異常，且與預后密切相關[3-4]，但與胰腺癌相關的研究較少。本研究旨在探討胰腺癌患者術前、術后外周血淋巴細胞亞群和PLT水平的變化，及其與臨床病理參數之間的相關性。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取復旦大學附屬華山醫院2019年1—5月接受手術治療的66例胰腺癌患者，其中男35例、女31例，年齡（60.05±11.34）歲。選取同期體檢健康者64名作為對照組，其中男34名、女30名，年齡（56.91±8.33）歲。所有胰腺癌患者均經術后病理檢查確診，符合胰腺癌診斷標準，胰腺癌的TNM分期采用第7版美國聯合腫瘤委員會的病理分期標準[5]。病理結果包括腫瘤大小、組織分級及淋巴結轉移等，臨床資料完整。排除標準：（1）合并其他腫瘤；（2）術前經過化療、放療等抗腫瘤治療；（3）有血液系統或自身免疫性疾病；（4）有感染性疾病或近期有急、慢性炎癥疾病；（5）手術方式合并有脾臟切除術，或使用影響PLT的藥物等。2個組之間年齡、性別等基本資料差異無統計學意義（P>0.05）。本研究經復旦大學附屬華山醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑

PLT計數采用XN-9000血液分析儀（日本Sysmex公司）及配套試劑測定。淋巴細胞亞群[CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、B細胞和自然殺傷（natural killer，NK）細胞]采用FACSCantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）及配套試劑、校準微球檢測。

1.3 檢測方法

采用乙二胺四乙酸抗凝管采集胰腺癌患者術前1周、術后第7天和體檢健康者的清晨空腹外周靜脈血1.5～2 mL，共采集2管，搖勻后立即送檢。按照血常規操作規程在2 h內完成PLT檢測，檢測前所有質控均在控。淋巴細胞亞群（CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、B細胞和NK細胞）檢測方法為：向2支流式試管中分別添加CD3+/CD4+/CD45+/CD8+和CD3+/CD16+CD56+/CD45+/CD19+單克隆抗體20 μL，然后每管添加50 μL抗凝全血，充分均勻，室溫避光孵育15 min后，添加450 μL溶血劑（溶血劑已1∶9稀釋），15 min后上機檢測，檢測前用校準微球進行校準，并保證所有質控均在控。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。正態分布數據用±s表示，組間比較采用t檢驗。淋巴細胞亞群與PLT的相關性采用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組術前、術后及對照組外周血淋巴細胞亞群和PLT水平比較

與對照組比較，胰腺癌組術前外周血中淋巴細胞亞群CD3+T細胞和CD3+CD4+T細胞明顯降低（P<0.001），CD3+CD8+T細胞和PLT水平明顯升高（P<0.05、P<0.001），B細胞和NK細胞水平差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

胰腺癌組術后CD3+T細胞和CD3+CD4+T細胞較術前明顯升高（P<0.01、P<0.001），PLT水平較術前明顯降低（P<0.01），CD3+CD8+T細胞、B細胞和NK細胞水平差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

胰腺癌術后組外周血C D 3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、B細胞、NK細胞、PLT水平與對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 胰腺癌患者術前淋巴細胞亞群和PLT水平與腫瘤臨床病理參數的關系

胰腺癌患者術前外周血CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、B細胞、NK細胞、PLT水平與年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、分化程度及有無神經浸潤無關（P>0.05），外周血CD3+CD4+T細胞、PLT水平與TNM分期、有無淋巴結轉移有關（P<0.05），CD3+CD8+T細胞、B細胞、NK細胞水平與TNM分期、有無淋巴結轉移無關（P>0.05）。見表2。

表1 胰腺癌術前組和對照組外周血淋巴細胞亞群和PLT水平比較 ±s

表1 胰腺癌術前組和對照組外周血淋巴細胞亞群和PLT水平比較 ±s

注：與對照組比較，*P<0.05、**P<0.001；與術前比較，#P<0.05、##P<0.001

B細胞/% NK細胞/% PLT計數/（×109/L）對照組 64 71.83±5.42 44.77±5.45 19.88±4.88 15.06±4.05 21.17±4.53 168.47±35.62胰腺癌組術前 66 64.06±13.69** 35.76±10.93** 22.67±8.25* 14.32±7.91 20.82±12.36 204.64±62.30**術后 66 70.85±11.32## 47.38±9.23## 20.94±8.04 15.50±6.50 20.94±9.40 167.83±56.14#組別 例數 CD3+T細胞/%CD3+CD4+T細胞/%CD3+CD8+T細胞/%

表2 胰腺癌患者術前淋巴細胞亞群和PLT水平與臨床病理參數的關系

2.3 胰腺癌患者術前外周血淋巴細胞亞群與PLT水平的相關性分析

Spearman相關分析結果顯示，胰腺癌患者術前外周血CD3+CD4+T細胞水平與PLT水平呈負相關（r=-0.44，P<0.01），CD3+T細胞（r=-0.14）、CD3+CD8+T細胞（r=-0.04）、B細胞（r=-0.10）、NK細胞（r=0.11）水平與PLT水平均不相關（P>0.05）。

3 討論

胰腺癌預后極差，術后5年生存率<5%[6]。目前手術是治療胰腺癌的主要手段，腫瘤患者自身的免疫力也是評估患者預后的重要因素。有研究報道顯示，腫瘤的發生、發展和轉移與機體的免疫監視密切相關[7]，機體抗腫瘤的免疫監視功能中淋巴細胞介導的細胞免疫一直被認為是最主要的免疫方式[8]。細胞免疫的主要效應細胞是T細胞，CD3+T細胞反映機體總的細胞免疫狀態，CD3+CD4+T細胞是輔助性T細胞，可輔助誘導其他免疫細胞共同發揮抗腫瘤作用，CD3+CD8+T細胞是抑制性T細胞，通過自身及抑制因子起負向免疫調控作用。B細胞主要反映機體的體液免疫功能，其數量降低與體液免疫缺陷相關。NK細胞主要介導機體的非特異性免疫。本研究結果顯示，與對照組比較，胰腺癌組術前外周血中CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞水平明顯降低（P<0.001），CD3+CD8+T細胞明顯升高（P<0.05），提示胰腺癌患者在荷瘤狀態下機體處于免疫抑制狀態，其機制可能是腫瘤細胞產生大量的免疫抑制因子，使CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞明顯減少，同時低下的免疫功能為腫瘤生長、轉移創造條件[9]。胰腺癌組術后CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞水平均明顯高于術前（P<0.01、P<0.001），CD3+CD8+T細胞、B細胞和NK細胞水平差異均無統計學意義（P>0.05），胰腺癌組術后各指標與對照組比較差異也均無統計學意義（P>0.05），表明手術后胰腺癌患者的免疫功能有所恢復，且主要以細胞免疫恢復為主。本研究結果還顯示，術前CD3+CD4+T細胞水平與胰腺癌的TNM分期和淋巴結轉移有關，這表明CD3+CD4+T細胞可能參與胰腺癌轉移、侵襲的免疫調節機制。

PLT不僅在止血、血栓形成和促進傷口愈合過程中發揮重要作用，同時與機體免疫和腫瘤發生、發展密切相關[10]。PLT能夠從多途徑促進腫瘤的轉移，主要機制為PLT可與腫瘤細胞形成癌栓保護層，利于腫瘤細胞在循環運輸過程中逃避免疫監視；PLT可幫助腫瘤細胞免受血流高剪切力的損傷，從而保護腫瘤細胞不被機體防御機制清除；PLT自身也可降低免疫監視作用，招募粒細胞促進早期轉移微環境形成[11]。新生腫瘤也可通過分泌白細胞介素-6和組織因子等活性物質促進PLT的生成和活化，而活化的PLT可分泌如血管內皮生長因子、PLT衍生生長因子等進一步促進腫瘤新生血管的形成和腫瘤的發展[12]。有研究結果顯示，多種腫瘤均出現PLT水平升高，且PLT水平升高與預后有關[13-14]。本研究結果顯示，與對照組比較，胰腺癌組術前外周血PLT水平明顯升高（P<0.01），且與胰腺癌不同組織分級和淋巴結轉移明顯相關（P<0.01），術后第7天患者外周血PLT水平基本恢復至正常水平，進一步表明PLT在胰腺癌的發生、發展及預后監測方面發揮重要作用。

淋巴細胞和PLT均是參與免疫炎癥和血栓形成過程的重要細胞成分，PLT通過釋放多種促有絲分裂活性介質對CD3+CD4+T淋巴細胞的增殖發揮調節作用[15]。PLT因子4通過減少白細胞介素-2的生成，對CD3+/CD28抗體誘導的CD3+CD4+T淋巴細胞的增殖產生抑制作用[16]。淋巴細胞和PLT之間可通過直接結合或在趨化因子、黏附分子等介導下影響彼此功能。本研究結果顯示，胰腺癌患者術前外周血CD3+CD4+T細胞水平降低、PLT水平升高，提示CD3+CD4+T和PLT共同參與了胰腺癌的發生和發展，其機制可能與PLT通過促有絲分裂介質或其他分子抑制CD3+CD4+T淋巴細胞增殖有關。本研究結果還顯示，胰腺癌患者術前CD3+CD4+T淋巴細胞與PLT水平呈負相關（r=-0.44，P<0.01），推斷兩者對胰腺癌的進程和預后可能存在協同效應。然而本研究納入的病例數較少，后續還需加大樣本量進行驗證，另外還需對CD3+CD4+T細胞和PLT在胰腺癌發生、發展和轉移中的分子機制進行深入研究。

綜上所述，胰腺癌患者細胞免疫功能受到嚴重抑制，而經手術治療后患者免疫功能可有所恢復。初步證實淋巴細胞免疫異常、PLT與胰腺癌患者疾病的發生、發展過程相關。