血清蛋白電泳識(shí)別M蛋白的規(guī)則制定及其在健康人群M蛋白篩查中的應(yīng)用

徐 雙，路 瑾，趙 磊，裴 林，賈 玫，榮 嶸

（1.北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100044；2.北京大學(xué)血液病研究所，北京 100044）

單克隆免疫球蛋白血癥（monoclonal gammopathy，MG）是由克隆性漿細(xì)胞異常增殖引起的一組疾病，包括多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、冒煙型骨髓瘤（smoldering multiple myeloma，SMM）、原發(fā)性巨球蛋白血癥（Waldenstr?m macroglobulinemia，WM）、原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性、意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥（monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS）等，其特征為血中出現(xiàn)單克隆免疫球蛋白或其多肽鏈亞單位，即M蛋白[1]。全自動(dòng)血清蛋白電泳儀可以有效地檢測血清中各種蛋白成分的變化，并以圖形的形式顯示，為臨床提供準(zhǔn)確、可靠的診斷依據(jù)及預(yù)后觀察指標(biāo)。目前，國外有多篇關(guān)于篩查健康人群M蛋白血癥及其發(fā)病率的報(bào)道[2-4]，我國尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，本研究收集1 170份健康體檢人群樣本進(jìn)行血清蛋白電泳，統(tǒng)計(jì)健康人群M蛋白血癥的發(fā)病率，并嘗試建立本實(shí)驗(yàn)室血清蛋白電泳識(shí)別M蛋白的規(guī)則，提高其在M蛋白篩查中的準(zhǔn)確性和靈敏度，為臨床提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年4月—2018年4月北京大學(xué)人民醫(yī)院1 170名健康體檢者的血清樣本。另收集除血液科、腎內(nèi)科、風(fēng)濕免疫科、骨腫瘤科、肝病科、老年科患者外的患者血清樣本236例及臨床隨機(jī)血清樣本312例。本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2017PHB005-01），并申請(qǐng)知情豁免。

1.2 儀器與試劑

Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀、HYDRASYS 2全自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳儀及試劑均購自法國Sebia公司。

1.3 方法

1.3.1 血清蛋白電泳 采用Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行血清蛋白電泳。

1.3.2 免疫固定電泳 采用HYDRASYS 2全自動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳儀及5種抗血清[抗γ重鏈（IgG）、抗α重鏈（IgA）、抗μ重鏈（IgM）、抗κ輕鏈（游離κ輕鏈和非游離κ輕鏈）、抗λ輕鏈（游離λ輕鏈和非游離λ輕鏈）]進(jìn)行血清免疫固定電泳。

1.3.3 結(jié)果判讀 由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員同時(shí)判斷血清蛋白電泳及免疫固定電泳結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 血清蛋白電泳與免疫固定電泳的符合率

首先制定本實(shí)驗(yàn)室5條識(shí)別M蛋白的規(guī)則：（1）γ區(qū)異常峰；（2）β2區(qū)高于β1區(qū)；（3）β1區(qū)出現(xiàn)異常峰；（4）α2區(qū)出現(xiàn)異常峰（需排除炎癥因素）；（5）γ區(qū)低于參考區(qū)間；其中異常峰包含典型M峰、雙峰或類似的可疑高尖峰，見圖1。

圖1 本實(shí)驗(yàn)室5條識(shí)別M蛋白的規(guī)則

對(duì)312例臨床隨機(jī)血清樣本進(jìn)行血清蛋白電泳，依據(jù)上述規(guī)則篩選出疑似有M蛋白的樣本20例，有M峰的樣本8例。隨后將312例臨床隨機(jī)血清樣本全部進(jìn)行免疫固定電泳，其中20例疑似有M蛋白的樣本中有7例確證含有M蛋白，8例有M峰的樣本全部為M蛋白陽性；另有1例血清蛋白電泳圖形不典型，判斷為陰性結(jié)果，而免疫固定電泳結(jié)果為IgA κ型M蛋白，為漏診病例，見圖2。以免疫固定電泳結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，血清蛋白電泳的漏檢率為0.32%（1/312）。312例隨機(jī)臨床血清樣本中M蛋白陽性率為5.12%（16/312）。

圖2 漏檢病例血清蛋白電泳圖及免疫固定電泳圖

2.2 健康體檢人群中M蛋白的陽性率及不同性別之間的比較

對(duì)1 170名健康體檢者血清樣本進(jìn)行血清蛋白電泳，篩選出可疑樣本76例（6.5%）。經(jīng)免疫固定電泳確證，其中25例含有M蛋白，總陽性率為2.14%（25/1 170）。

將1 170名健康體檢者分為5個(gè)年齡組：41～50歲組、51～60歲組、61～70歲組、71～80歲組、≥81歲組。5個(gè)年齡組的陽性率分別為0.98%、0、2.07%、4.00%、5.31%。1 170名健康體檢者中男性455名，M蛋白總陽性率為2.64%（12/455）；女性715名，M蛋白總陽性率為1.82%（13/715）。見表2、圖3。

表2 不同年齡及性別健康體檢者M(jìn)蛋白陽性率

圖3 健康體檢者各年齡組不同性別之間M蛋白陽性率的比較

2.3 健康體檢人群M蛋白類型分布

在經(jīng)免疫固定電泳確證的25例M蛋白陽性樣本中，IgG型占60%，其中IgG κ型9例（36%）、IgG λ型6例（24%）；IgA型占4%，其中IgA κ型1例（4%），無IgA λ型；IgM型占24%，其中IgM κ型5例（20%）、IgM λ型1例（4%）；輕鏈型占12%，其中游離λ型3例（12%），無游離κ型。

2.4 臨床樣本M蛋白陽性率統(tǒng)計(jì)

對(duì)236例除血液科、腎內(nèi)科、風(fēng)濕免疫科、骨腫瘤科、肝病科、老年科外患者的血清樣本進(jìn)行M蛋白血癥的篩查及確認(rèn)，共檢出M蛋白血癥10例，陽性率為4.24%。見表3、圖4。

表3 236例臨床樣本各年齡組M蛋白血癥的陽性率

圖4 健康體檢人群與臨床患者各年齡組M蛋白陽性率的比較

3 討論

血清蛋白電泳對(duì)分析血清蛋白質(zhì)成分有很大的幫助，有幾種典型圖形可以對(duì)相關(guān)疾病起提示、輔助診斷的作用。血清蛋白電泳的另一重要作用是篩查M蛋白，確診M蛋白血癥，并對(duì)M蛋白進(jìn)行定量。本研究依據(jù)徐玲玲等[5]和KEREN等[6-7]的研究結(jié)果制定了本實(shí)驗(yàn)室5條識(shí)別、篩選M蛋白的規(guī)則：（1）γ區(qū)異常峰；（2）β2區(qū)高于β1區(qū)；（3）β1區(qū)出現(xiàn)異常峰；（4）α2區(qū)出現(xiàn)異常峰（需排除炎癥因素）；（5）γ區(qū)低于參考區(qū)間；其中異常峰包含典型M峰、雙峰或類似的可疑高尖峰。M蛋白在血清蛋白電泳中分布于α2～γ區(qū)。另外，輕鏈型漿細(xì)胞疾病患者由于漿細(xì)胞合成重鏈的能力被選擇性抑制，正常免疫球蛋白含量均降低，導(dǎo)致γ區(qū)低于參考區(qū)間，因此將其作為第5條篩選規(guī)則。當(dāng)血清蛋白電泳出現(xiàn)這幾種異常分布時(shí)，應(yīng)考慮可能存在M蛋白，需采用免疫固定電泳或免疫分型進(jìn)一步分析。

在進(jìn)行健康體檢人群M蛋白篩查前，本研究先對(duì)識(shí)別M蛋白的規(guī)則進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)312例臨床隨機(jī)樣本進(jìn)行血清蛋白電泳，依據(jù)制定的識(shí)別規(guī)則，共篩選出28例可疑樣本（含有M峰或可疑M峰），將此312例樣本全部進(jìn)行免疫固定電泳，有16例樣本確認(rèn)為M蛋白陽性。312例臨床隨機(jī)樣本中，1例樣本免疫固定電泳結(jié)果為IgA κ型M蛋白，但其M蛋白濃度較低，同時(shí)由于IgA型M蛋白形成較寬的單克隆條帶，導(dǎo)致M峰不典型，雖然其血清蛋白電泳圖形中β2區(qū)高于β1區(qū)，但因?yàn)槭侨藶榕凶x的原因而發(fā)生漏檢，因此應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行制定的M蛋白識(shí)別規(guī)則。在臨床工作中，如高度懷疑為漿細(xì)胞疾病的患者，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行血、尿免疫固定電泳或其他相關(guān)檢測，避免漏檢。

KATZMANN等[1]將出現(xiàn)可以定量的M峰、模糊的條帶、低丙種球蛋白血癥（丙種球蛋白<5.5 g/L）、β組分增加（β組分蛋白≥l6 g/L）或α組分增加（α組分蛋白≥15 g/L）作為篩選異常血清蛋白組分的標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，1 877例M蛋白血癥患者（疾病譜包括MM、WM、SMM、MGUS、漿細(xì)胞瘤、POEMS綜合征等）血清蛋白電泳的陽性率為79%。邵文琦等[8]將峰形態(tài)異常[電泳條帶提示α1、α2、β1、β2、γ區(qū)中出現(xiàn)異常形態(tài)（雙峰、多重峰、重疊峰）]和峰組分異常（電泳條帶提示α1區(qū)7.3%、、α2區(qū)>12%、β1區(qū)>7%排除血紅蛋白條帶、β2區(qū)>7%排除纖維蛋白原條帶、γ區(qū)>20%排除肝硬化特征性β-γ橋）作為篩選M蛋白的條件，對(duì)22 193例樣本進(jìn)行血清蛋白電泳，篩選出可疑樣本354例（1.60%），對(duì)可疑樣本進(jìn)行免疫固定電泳，其中有206例樣本陽性，總陽性率為0.93%。由于多克隆球蛋白濃度升高也會(huì)造成陽性結(jié)果，因而本研究并未將各區(qū)帶組分的定量結(jié)果作為篩選規(guī)則。相對(duì)而言，本研究建立的M蛋白篩選規(guī)則更簡便、直觀，無需參考其他檢查的結(jié)果，但由于沒有過多的量化標(biāo)準(zhǔn)，而是直觀地以圖形判斷，因此對(duì)技術(shù)人員的要求較高。另外，本研究將312例臨床隨機(jī)血清樣本全部進(jìn)行免疫固定電泳確證，能更全面、真實(shí)地反映臨床患者M(jìn)蛋白的陽性率。

考慮到M蛋白血癥在40歲以下人群中發(fā)病率極低，因此本研究選取的研究對(duì)象為40歲以上人群。本研究對(duì)1 170名40歲以上的健康體檢者血清樣本進(jìn)行血清蛋白電泳，依據(jù)建立的M蛋白識(shí)別規(guī)則篩選出可疑樣本，隨后采用免疫固定電泳對(duì)可疑樣本進(jìn)行確證及分型。結(jié)果顯示，在1 170名健康體檢者中，有25例（2.14%）M蛋白陽性。本研究的M蛋白血癥陽性率高于法國40歲以上人群的陽性率（1.34%）[2]。本研究70歲以上人群M蛋白的陽性率為4.47%，高于美國白色人種人群的陽性率（3.8%），但低于美國黑色人種人群的陽性率（8.4%）[3]。這可能與地區(qū)及人種差異有關(guān)。另外，如研究對(duì)象年齡范圍不同，M蛋白陽性率也有一定差異[9-10]，但整體趨勢(shì)均為隨年齡的增加而升高。本研究結(jié)果顯示，男性M蛋白總陽性率（2.64%）高于女性（1.82%），與SALEUN等[2]的研究結(jié)果[40歲以上人群男性陽性率（1.67%）高于女性（1.03%）]一致，未出現(xiàn)OGMUNDSDóTTIR等[4]的研究中某個(gè)年齡段女性患病率高于男性的情況。25例M蛋白陽性的健康體檢者中，IgG型M蛋白陽性率最高（60%），其次為IgM型（24%）。由于本研究的樣本量偏小，今后將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行全國范圍內(nèi)的健康人群M蛋白篩查。

本研究結(jié)果顯示，236例臨床樣本M蛋白的陽性率為4.24%，高于健康體檢者，與姜紅浩等[11]的研究結(jié)果（皮膚病患者陽性率為 4.05%）一致。由于血液科、腎內(nèi)科、骨腫瘤科的就診患者M(jìn)蛋白血癥發(fā)病率較高，風(fēng)濕免疫科、肝病科、老年科的就診患者會(huì)因原發(fā)病導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂或免疫球蛋白水平異常，繼而出現(xiàn)繼發(fā)性MG[12]，因此本研究在收集樣本時(shí)排除了以上科室就診患者的樣本，但入組患者M(jìn)蛋白的檢出率仍高于健康體檢者，原因可能有2個(gè)：（1）由于M蛋白血癥為全身性疾病，因此會(huì)造成血液系統(tǒng)以外的其他臨床癥狀而就診于其他科室，如本研究中有1例以月經(jīng)過多為首發(fā)癥狀就診于婦科的患者。（2）急性或慢性疾病，如骨關(guān)節(jié)炎、腫瘤或不明原因發(fā)熱的患者體內(nèi)存在細(xì)菌性炎癥或無菌性炎癥，炎癥可通過Fc片段影響免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，產(chǎn)生克隆的非功能性免疫球蛋白。

綜上所述，血清蛋白電泳對(duì)分析血清蛋白質(zhì)分布有較高的價(jià)值，是篩查M蛋白血癥快速、靈敏的方法之一，結(jié)合免疫固定電泳分型，可早期發(fā)現(xiàn)MGUS、MM、WM等疾病[12]。為避免血清蛋白電泳的漏診，應(yīng)制定篩選M蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，并由經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員進(jìn)行判讀。由于輕鏈型M蛋白會(huì)由腎小球?yàn)V出或M蛋白濃度較低，導(dǎo)致血清蛋白電泳的M峰不典型或結(jié)果呈陰性，因此高度懷疑血液系統(tǒng)疾病時(shí)應(yīng)同時(shí)進(jìn)行尿蛋白電泳及血清或尿液的免疫固定電泳，以提高相關(guān)疾病的檢出率。建議對(duì)40歲以上人群常規(guī)進(jìn)行M蛋白篩查，以便能早期發(fā)現(xiàn)MGUS等疾病。