4種SARS-CoV-2核酸檢測試劑一致性評價

顏新生，楊薈薈，蒿葉霞，胡元萍，張李濤，廖 鑫，范慶坤，劉澤金

（1.武漢亞心總醫院檢驗科，湖北 武漢 430056；2.武漢亞洲心臟病醫院檢驗科，湖北 武漢 430022）

目前，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的檢測仍是新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的主要確診依據[1]。診斷COVID-19的2種分子生物學方法中，一種是病毒的基因測序，一種是實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）核酸檢測。基因測序需要較昂貴的設備以及生物信息團隊對結果進行分析解讀，檢測成本高、周期長，難以普及[2]。因此，臨床上主要依靠實時熒光RT-PCR核酸檢測方法。截至2020年2月26日，我國相關部門依據《醫療器械應急審批程序》先后批準了6家企業的6種實時熒光RTPCR法SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒，全力服務疫情防控需要，為COVID-19的診斷提供了重要保障。同時不斷有企業研發、生產相關核酸檢測試劑盒，產品供應已經得到了極大的緩解。然而，在臨床實際應用過程中，核酸檢測結果受到采樣部位、采樣時機、標本的運輸、保存條件、實驗室的操作流程和檢測試劑的敏感性、特異性等多種因素的影響。通過加強人員的培訓可以很大程度解決標本的問題，與此同時，高質量的核酸檢測試劑就顯得尤為重要[3]。正常情況下，從研發到取得核酸檢測類試劑盒注冊證需要3～5年，其間需要不斷優化，并通過大量臨床標本的驗證。由于疫情初期核酸檢測試劑盒研發時間緊迫，臨床試驗規模太小，缺乏大量科學數據支撐，核酸檢測試劑盒特別是初代批次試劑盒的檢測性能不盡如人意，給臨床診斷造成了較大的困擾。本研究在現有的條件下，比較4家已批準上市的SARSCOV-2核酸檢測RT-PCR試劑盒的檢測性能，供各臨床實驗室參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2020年2月18—24武漢亞心總醫院住院的COVID-19患者鼻咽拭子標本204例，患者男104例、女100例，年齡12～92歲。本研究經武漢亞心總醫院倫理審查委員會審核通過（倫理號：WAGHMEC-KY-2020004），并批準予以豁免患者知情同意。

1.2 儀器與試劑

病毒采樣管（江蘇康健醫療用品有限公司），磁珠法病毒核酸提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司），Kingfisher Duo Prime核酸提取儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），Cobas z480實時熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司），SLAN-96S實時熒光定量PCR儀（上海宏石醫療科技有限公司）。選取4家不同企業生產的已取得緊急審批注冊證的核酸檢測試劑盒，4種試劑基本情況見表1。

表1 4種SARS-CoV-2核酸檢測試劑基本情況

1.3 SARS-CoV-2核酸檢測

采用磁珠法病毒核酸提取試劑盒對鼻咽拭子標本進行RNA病毒的提取。采用實時熒光RT-PCR技術，按照試劑說明書建議，對SARSCov-2進行基因檢測。其中A、B、C試劑針對ORF1ab基因和N基因進行雙靶標檢測，D試劑針對SARS-Cov-2高度保守區域ORF1ab基因進行單靶標檢測。4種試劑均設置了內參對照，用于對標本采集、保存和運輸以及核酸提取過程進行監控，減少假陰性結果。核酸檢測結果判定參考試劑說明書建議的Ct值，并根據《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》建議[4]，對于ORF1ab基因和N基因同時陽性的結果，報告為陽性，若僅ORF1ab或N基因其中之一檢測結果為陽性，判定為可疑，需復查或重新采樣復查。

1.4 統計學方法

采用MedCalc16.2.1軟件進行數據分析，2×2四格表總結檢測結果，對各試劑盒的一致性進行kappa一致性分析，不同試劑間的一致性比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4種核酸檢測試劑盒對SARS-CoV-2的整體檢出率比較

在4種試劑整體檢出率（任一基因檢出即視為檢出）和ORF1ab基因檢出率的比較中，采用在臨床診斷為COVID-19的基礎上，4種試劑任一試劑檢出陽性為參考。在N基因檢出率比較中，采用在臨床診斷為COVID-19的基礎上，A、B、C 3種試劑任一試劑檢出陽性為參考。任一試劑檢出陽性標本123例，全陰性標本81例。在整體檢出率比較中，A、B、C、D 4種試劑陽性檢出率分別為72.4%、78.0%、59.3%和72.4%，不同試劑差異有統計學意義（P=0.011），見表2。

表2 4種試劑對SARS-CoV-2的整體檢出率比較

2.2 4種核酸檢測試劑盒對SARS-CoV-2的ORF1ab基因和/或N基因檢出率比較

204例標本中，針對ORF1ab基因共檢出107例陽性、97例陰性，A、B、C、D試劑對SARSCoV-2ORF1ab基因的檢出率分別為47.7%、31.8%、68.2%和83.2%，不同試劑檢出率差異有統計學意義（P<0.000 1），見表3。針對N基因共檢出105例陽性、99例陰性，A、B、C試劑對SARS-CoV-2N基因的檢出率分別為79.0%、90.5%和16.2%，不同試劑檢出率差異有統計學意義（P<0.000 1），見表4。此外，在4種試劑對ORF1ab基因檢出不一致的83例標本中，Ct值>34（弱陽性）的標本70例（84.3%）。在83例檢出不一致的樣本中，試劑A、B、C、D分別檢出26例（31.3%）、10例（12.0%）、49例（59.0%）和64例（77.1%）。

表3 4種試劑對SARS-CoV-2的ORF1ab基因的檢出率

表4 A、B、C 3種試劑對SARS-Cov-2的N基因的檢出率

3 討論

SARS-CoV-2是一種新型β屬冠狀病毒，屬于單鏈RNA病毒，可引起人類呼吸道感染[5]，該冠狀病毒為第7種可感染人類的冠狀病毒家族成員[6]。對SARS-CoV-2的核酸檢測是COVID-19的確診依據和痊愈出院指標。

本研究結果表明，4種檢測試劑盒對SARSCoV-2，特別是對弱陽性標本的檢出率存在較大差異，可能與試劑引物設計和探針設計有關，也可能與模板量或各組分在體系中的配比有關，從而導致檢測的靈敏度不高。由于疫情突發，各企業緊急投入試劑研發和生產，初代批次試劑盒難免存在問題，有一定的漏檢率，應對可疑結果使用另一種試劑盒進行復檢。本研究只針對現有的試劑批號進行比較，存在一定的局限性，不能完全代表其他批次試劑的檢測性能。在實際應用過程中，特別是初代批次試劑盒的使用過程中，應盡可能對不同品牌和批號的試劑盒進行比較驗證，檢測結果務必結合臨床判斷，以彌補初代試劑盒的缺陷。另外，還需要關注和驗證標本采集管、提取試劑和擴增儀器與各品牌試劑盒的匹配適用性，以找到最優條件，最大程度提高試劑盒的敏感性和特異性。

隨著COVID-19出院患者的增多，其病毒核酸檢測“復陽”情況受到廣泛關注，有COVID-19患者治愈出院后，再次出現咽拭子核酸檢測結果陽性[7]。本研究團隊小樣本研究結果顯示，數字聚合酶鏈反應的敏感性要比目前RTPCR高5～10倍，因此出院前的2次核酸檢測陰性結果很有可能是由于標本中的病毒載量低于試劑盒最低檢測限導致的假陰性結果。有條件的實驗室可采用更敏感的數字聚合酶鏈反應技術來降低假陰性情況的發生，同時應關注檢驗前、中、后各環節其他影響因素，注意采樣部位和方式、運輸和保存條件以及提取擴增環節的質量控制。并把抗體的檢測作為核酸檢測的有效補充，提高實驗室檢測的特異性和檢出率[8]，從而降低漏診和誤診帶來的風險。