質譜技術直接鑒定報陽血培養細菌可行性分析

王軍杰，馬 冰，李 軼，閆文娟，王山梅，馬 瓊，張江峰，許俊紅，袁有華

（1. 周口市鹿邑真源醫院檢驗科，河南 周口 477200；2.河南省人民醫院檢驗科，河南 鄭州 450003）

血流感染（bloodstream infection，BSI）發展迅速、病死率高，是醫院最危重的感染之一[1]。血培養是BSI診斷的金標準。對于報陽的血培養，傳統的實驗室報告流程包括革蘭染色鏡檢、傳代分離培養、基于表型的生化鑒定和抗菌藥物體外藥物敏感性試驗等步驟，出具報告需要48～72 h，且每延遲1 h均可能增加患者的病死率。如果病原菌生長條件要求苛刻或生化惰性，則周期更長。因此，對血培養報陽樣本的病原菌進行快速、準確的鑒定顯得尤為重要[2]。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）無需進行常規的革蘭染色、氧化酶、觸酶和生化反應，數分鐘內就可完成鑒定比對，操作簡便、快速、通量高、成本低，是臨床微生物檢驗革命性的發展。本研究擬采用MALDI-TOF MS直接對血培養陽性樣本進行菌種鑒定，并同步進行傳統細菌培養常規生化鑒定，比較2種方法結果的一致性，評估質譜技術在BSI診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2018年7—9月河南省人民醫院臨床送檢的非重復報陽血培養443瓶。入選標準：全自動血培養系統發出陽性報警，經常規涂片革蘭染色鏡檢確認。排除標準：報陽培養物常規革蘭染色鏡檢結果為無細菌。同一患者同時或先后送檢多瓶血培養，取最先報陽的血培養，以避免重復。

1.2 儀器與試劑

BACTEC FX血培養系統、需氧和厭氧血培養瓶、Phoenix 100全自動微生物分析系統及藥物敏感性試驗板條（美國BD公司），Microflex LT/SH全自動快速生物質譜檢測系統、MSP96孔靶板和α-氰基-4-羥基肉桂酸（德國Bruker Daltonik公司），甲酸與乙腈（美國Sigma-Aldrich公司），血平板、麥康凱平板和巧克力平板（鄭州安圖公司）。

1.3 常規生化鑒定

將陽性培養物同時轉種于血平板、巧克力平板和麥康凱平板，獲得純菌落后采用Phoenix 100全自動生化鑒定藥敏系統進行細菌鑒定與體外藥物敏感性試驗，結果依據美國臨床實驗室標準化協會2018年相關標準進行判定。

1.4 質譜法鑒定

1.4.1 質譜前處理 本研究團隊通過預實驗比較了幾種不同的樣本處理方法，優化改良后制定了本實驗的標準操作流程。從報陽血培養瓶中取出3.0 mL血液轉入3.5 mL血漿分離膠管，1 600×g離心10 min。棄上清，加1.0 mL去離子水重懸沉淀，轉入1.5 mL Eppendorf離心管中，12 000×g離心3 min，棄去上層的水和細胞。再次重懸沉淀于1 mL去離子水，12 000×g離心3 min，再次棄去上層的水和細胞，小心吸除上層液體保留白色菌膜。取1 μL用于質譜分析。

1.4.2 質譜分析 取1 μL樣本提取物點樣于96孔不銹鋼質譜靶板，待干燥后再覆以1 μL 70%甲酸自然晾干。待干燥后再覆以1 μL基質液（α-氰基-4-羥基肉桂酸）自然晾干。完全干燥后，將靶板放入Microflex LT/SH全自動快速生物質譜檢測系統進行鑒定，輸入菌株信息，采集菌株質譜數據，利用Biotype 3.0軟件將人工采集到的圖譜與數據庫中的圖譜進行比對和結果分析，鑒定菌種，記錄質譜評分前2種非重復菌種的鑒定結果。分值≥2.000，判定為能有效鑒定至種水平；分值為1.700～2.000，判定為可有效鑒定至屬水平；分值<1.700，判定為鑒定結果不可靠。

1.5 統計學方法

采用FlexControl 3.0軟件、Biotype 3.0軟件、ChinProTool 3.0軟件（德國Bruker公司）進行數據分析。

2 結果

2.1 病原菌分布

排除7個假報陽血培養瓶，陽性培養物中共分離出436株細菌，其中革蘭陽性菌155株（35.6%）、革蘭陰性菌236株（54.1%）、真菌19株（4.4%）、厭氧菌12株（2.7%）、少見菌14株（3.2%），所有樣本均采用Microflex LT/SH全自動快速生物質譜檢測系統進行鑒定。155株革蘭陽性菌中，有147株（94.8%）質譜鑒定可信度分值≥1.700，115株（74.2%）鑒定可信度分值≥2.000。236株革蘭陰性菌中，有226株（95.8%）質譜鑒定可信度分值≥1.700，173株（73.3%）鑒定可信度分值≥2.000。19株真菌中，有16株（84.2%）質譜鑒定可信度分值≥1.700，5株（26.3%）鑒定可信度分值≥2.000。12株厭氧菌中，有9株（75.0%）質譜鑒定可信度分值≥1.700，8株（66.7%）鑒定可信度分值≥2.000。14株少見菌中，有13株（92.9%）質譜鑒定可信度分值≥1.700，7株（50.0%）鑒定可信度分值≥2.000。

2.2 革蘭陽性菌鑒定結果

155株革蘭陽性菌中，有127株（81.9%）2種方法鑒定結果一致。82.5%（85/103）的葡萄球菌屬鑒定結果一致，其中98株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達100%；78株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達85.9%（67/78）。66.7%（14/21）的鏈球菌屬2種方法鑒定結果一致，其中19株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達84.2%（16/19）；14株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達85.7%（12/14）。95.8%（23/24）的腸球菌屬鑒定結果一致，其中24株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達100%；19株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達94.7%（18/19）。71.4%（5/7）的陽性桿菌鑒定結果一致，其中6株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達71.4%（5/6）；4株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達100%。見表1。

表1 革蘭陽性菌2種方法鑒定結果比較

2.3 革蘭陰性菌鑒定結果

236株革蘭陰性菌中，有219株（92.8%）2種方法鑒定結果一致。93.2%（178/191）的腸桿菌科細菌鑒定結果一致，其中182株可信度分值≥1.700，鑒定一致率為98.4%（179/182）；140株可信度分值≥2.000，鑒定一致率為95.7%（134/140）。90.5%（38/42）的非發酵菌鑒定結果一致，其中41株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達97.6%（40/41）；30株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達93.3%（28/30）。3株其他革蘭陰性桿菌鑒定結果一致率達100%；見表2。

2.4 真菌鑒定結果

19株真菌中，有16株（84.2%）2種方法鑒定結果一致。其中16株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達93.8%（15/16）；5株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達80.0%（4/5）。見表3。

2.5 厭氧菌和少見菌鑒定結果

12株厭氧菌中，有8株（66.7%）2種方法鑒定結果一致；其中9株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達77.8%（7/9）；8株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達87.5%（7/8）。14株少見菌中，有8株（57.1%）2種方法鑒定結果一致；其中13株可信度分值≥1.700，鑒定一致率達76.9%（10/13），7株可信度分值≥2.000，鑒定一致率達85.7%（6/7）。見表4、表5。

表2 革蘭陰性菌2種方法鑒定結果比較

表3 真菌2種方法鑒定結果比較

表4 厭氧菌2種方法鑒定結果比較

表5 少見菌2種方法鑒定結果比較

3 討論

質譜技術作為近些年發展起來的新技術，與傳統表型鑒定法相比，最大的優勢在于可直接鑒定血培養瓶中的細菌，從而節約再次分離培養鑒定的時間。本研究結果表明，質譜技術鑒定細菌可信度分值≥2.000的細菌以革蘭陽性菌（74.2%）最多，以下依次是革蘭陰性菌（73.3%）、厭氧菌（66.7%）、少見菌（50.0%）、真菌（26.3%），且2種方法鑒定結果一致率也以革蘭陰性菌（92.8%）最高，以下依次為革蘭陽性菌（81.9%）、真菌（84.2%）、厭氧菌（66.7%）、少見菌（57.1%），與文獻報道結果（質譜對革蘭陰性菌鑒定準確率高于革蘭陽性菌）[3]一致。在常見陽性菌，如金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、紋帶棒狀桿菌，尤其是屎腸球菌和糞腸球菌，以及常見陰性菌如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等的鑒定中，質譜技術的準確率很高[4]。本研究發現，在真菌（近平滑念珠菌、光滑念珠菌等）、厭氧菌（脆弱擬桿菌等）及少見菌（藤黃微球菌等）的鑒定中，質譜技術與常規鑒定方法的結果有非常高的一致性。質譜技術鑒定鏈球菌屬準確率較低可能與緩癥鏈球菌不同種之間的相似性較高（如緩癥鏈球菌、血鏈球菌和口腔鏈球菌）[5]有關。葡萄球菌屬主要是區分金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌，質譜技術對二者的鑒別診斷較為準確。從陽性血培養瓶中快速、準確地鑒定細菌是質譜技術的最大優勢。本研究在2 h內就能從陽性血培養瓶中得到種、屬水平的鑒定報告，對于BSI，尤其是重癥BSI患者來說意義重大。因此，在BSI診療中采用質譜技術，結合醫院和地區的耐藥性檢測數據，可合理選擇抗感染治療方案，即能覆蓋可能的病原體，又可避免廣譜抗菌藥物的過度使用。

本研究仍存在不足之處，如由于樣本數量的原因，有些細菌僅有1次鑒定結果，可能無法得出準確的結論，但本研究結果支持質譜技術可直接準確、快速地鑒定陽性血培養瓶中的細菌這一結論。雖然樣本處理流程、血培養瓶類型、常見菌種分布差異等可能導致不同研究中結果的差異[6]，但采用質譜技術可滿足臨床對BSI常見病原菌快速診斷的需求，可幫助臨床早期進行合理的抗菌藥物治療，提高BSI患者的生存率，值得推廣。