維生素D受體激活對小鼠膽管結扎所致肝纖維化的影響及其機制

楊 帆，李麗華

(錦州醫科大學基礎醫學院細胞生物學教研室，遼寧 錦州 121000)

肝纖維化是一種世界范圍內的高發病率的肝臟疾病，威脅患者生命。肝纖維化具有可逆性特征，因此肝纖維化的研究已經成為近年來研究的熱點。肝纖維化形成的中心環節是肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)激活，激活的HSC釋放細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，導致ECM在肝內累積，形成肝纖維化[1]。維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)是核激素受體超家族的一員,可被帕立骨化醇特異性激活。最近研究[2]表明: VDR可明顯降低HSC促纖維化因子膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ，Col Ⅰ) 的表達，緩解硫代乙酰胺導致的肝纖維化。VDR對膽總管結扎(bile duct ligation， BDL)導致的肝纖維化的作用機制尚不清楚。越來越多文獻[3]證明：在氧化應激狀態下，過量的氧自由基(reactive oxygen species，ROS)可以通過調節信號通路，激活HSC, 形成肝纖維化。VDR可以抑制線粒體膜電位，從而抑制ROS的產生，保護細胞免受氧化應激損傷[4]。此外，研究[5]顯示：VDR激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1α)使線粒體沉默交配型信息調節3(silence mating type information regulation 3，Sirt3)表達水平升高，降低骨骼肌中的氧化應激反應。Sirt3屬于sirtuin家族，可調節線粒體蛋白的乙?；p少氧化應激[6]。Sirt3還參與通過調控琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性抑制HSC的激活，減輕肝纖維化[7]。本文作者探討激活的VDR通過調控Sirt3蛋白表達對BDL導致肝纖維化的影響，為其臨床治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器SPF級C57BL/6小鼠60只，體質量22～25 g，7～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0006。小鼠在標準環境下飼養, 飲食自由。帕立骨化醇粉末 (美國Sigma公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶)，二氫乙啶(dihydroethidium，DHE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，天狼猩紅(Sirus red)試劑盒(北京索萊寶公司)，Sirt3抗體和Col Ⅰ抗體(美國Abcam公司)，8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase，GADPH)抗體、α-平滑肌蛋白(alpha-smooth muscle，α-SMA)抗體和肌動蛋白β(beta actin，β-actin)抗體及HRP標記羊抗兔二抗和HRP標記羊抗鼠二抗均購買自美國Proteintech公司， ECL顯影液(美國Bio-Rad公司)。ECL發光成像系統(美國Bio-Rad公司),Thermo Multisan MK3酶標儀(美國Thermo公司)，Olympus BX-53型顯微鏡和Olympus DP-73倒置熒光顯微鏡均購自日本Olympus公司。

1.2 實驗動物分組和藥品配制60只C57BL/6小鼠隨機分為假手術組、假手術后給藥組、模型組和治療組，每組15只。實驗中動物飼養及使用均符合錦州醫科大學動物倫理委員會要求。將帕立骨化醇粉末溶于60%的丙二醇溶液中，存儲于-80℃冰箱。腹腔注射使用的溶液需要進一步用生理鹽水稀釋。根據有關文獻[8]將帕立骨化醇的小鼠劑量確定為200 ng·kg-1。

1.3 BDL模型制備和用藥小鼠適應性飼養1周進行實驗。所有小鼠術前8 h禁食，手術時室內溫度保持在25℃左右。腹腔注射戊巴比妥鈉(65 mg·kg-1)麻醉小鼠，乙醇消毒皮膚。模型組小鼠從劍突到恥骨聯合進行腹部正中切口，暴露膽總管，雙線結扎膽總管并中間離斷，腹部縫合。假手術組和假手術后給藥組小鼠除雙線結扎膽管并中間離斷外，其他手術過程均與模型組小鼠相同。假手術后給藥組和治療組小鼠在手術前3 d腹腔注射200 ng·kg-1帕立骨化醇溶液，每周3次，觀察小鼠狀態。手術結束后恢復性飼養，治療組小鼠繼續注射帕立骨化醇，于手術后的第5天取材。

1.4 HE染色觀察小鼠肝組織病理形態表現用4%多聚甲醛固定小鼠肝組織，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片，石蠟烤片60℃過夜，二甲苯脫蠟梯度酒精復水后進行HE染色，顯微鏡下拍照，觀察小鼠肝組織病理形態表現。依據《病毒性肝炎防治方案》[9], 將肝纖維化程度分為S0～S4期。S0期：匯管區無或輕微炎癥，無纖維增生；S1期：匯管區輕微炎癥、匯管區及中央靜脈纖維化;S2期:匯管區炎癥較輕，但其周圍有纖維化并有纖維間隔形成；S3期：匯管區炎癥較重、纖維間隔形成，無肝硬化；S4期：匯管區炎癥嚴重, 假小葉形成。

1.5 天狼猩紅染色觀察小鼠肝組織纖維化程度冰凍切片恢復至室溫，4%多聚甲醛固定組織, 用1×PBS洗滌3次, 每次5 min。天狼猩紅染液染30 min。無水乙醇直接脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。熒光顯微鏡下觀察, 并采用圖像分析系統進行分析。

1.6 DHE染色檢測小鼠肝組織中ROS水平用4%多聚甲醛固定組織，30%蔗糖脫水，組織切片8 μm，4% 多聚甲醛固定組織15 min, 用1×PBS洗15 min，滴入DHE染液后37℃孵育30 min； 隨后切片再用1×PBS洗滌3次, 每次5 min, 熒光顯微鏡下觀察組織切片，并用Image J軟件分析紅色熒光強度，代表ROS水平。

1.7 Western blotting法檢測小鼠肝組織中Sirt3、OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平取小鼠肝組織0.02 g，加入200 μL蛋白裂解液，冰上充分勻漿裂解, 提取總蛋白液。BCA法進行蛋白定量，取約30 μg蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，90 V恒壓濕轉90 min，10% BSA封閉2 h。 一抗 (Sirt3、OGG1、α-SMA、Col Ⅰ均為1∶1 000稀釋) 4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min。室溫下二抗孵育2 h，TBST洗滌后ECL顯影，暗室曝光。用Image J軟件進行灰度值分析,目的蛋白條帶灰度值與內參照條帶灰度值比值代表目的蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組小鼠肝組織病理形態表現和纖維化程度HE染色結果顯示：假手術組和假手術后給藥組小鼠肝細胞排列整齊, 無炎性細胞浸潤，無膽管增生；模型組小鼠肝組織炎性細胞浸潤增多, 膽管明顯增生；與模型組比較，治療組小鼠肝組織炎性細胞浸潤減少，肝組織壞死灶明顯縮小(圖1，見插頁二)。天狼猩紅染色結果顯示：假手術組和假手術后給藥組小鼠肝組織無紅色膠原纖維樣物質圍繞在膽管和大的靜脈周圍；與假手術組和假手術后給藥組比較，模型組小鼠肝組織纖維化嚴重，在肝組織匯管區周圍有大量紅色膠原樣纖維物質沉積；與模型組比較，治療組小鼠肝組織匯管區及其大膽管周圍紅色纖維樣物質明顯減少，纖維化程度減輕(圖2，見插頁二)。

依據《病毒性肝炎防治方案》[9]，結合HE染色，將肝纖維化程度分為S0～S4期。假手術組和假手術后給藥組S0期和S1期肝纖維化小鼠所占百分率總和高于模型組；模型組S4期肝纖維化小鼠所占百分率為53.3%，治療組S4期肝纖維化小鼠所占百分率為6.6%，模型組S4期肝纖維化小鼠所占百分率遠高于治療組小鼠，肝纖維化嚴重。見表1。

表1 各組小鼠肝纖維化程度分期

2.2 各組小鼠肝組織中ROS水平DHE可以判斷細胞中ROS水平[10]。假手術組和假手術后給藥組小鼠匯管區及大膽管周圍紅色熒光弱；與假手術組和假手術后給藥組比較，模型組小鼠肝組織大膽管周圍及其匯管區紅色熒光增強，ROS水平升高；與模型組比較，治療組小鼠肝組織膽管周圍紅色熒光強度弱，ROS水平降低。見圖3(插頁三)。

2.3 各組小鼠肝組織中Sirt3、OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平與假手術組和假手術后給藥組比較，模型組小鼠肝組織中Sirt3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05), OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組小鼠肝組織中Sirt3蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖4和表2。

Lane 1: Sham operation group;Lane 2: Sham operation+paricalcitol group;Lane 3,4: Model group; Lane 5,6: Treatment group.

表2 各組小鼠肝組織中Sirt3、OGG1、α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平

3 討 論

肝纖維化是一種發生于肝臟的炎癥反應，多種疾病[11-12]均可導致肝纖維化。肝纖維化的過程涉及HSC的激活, α-SMA和Col Ⅰ是HSC激活的標志物[13-14]。正常的HSC處于靜息狀態，肝損傷時會激活HSC，HSC轉化為肌成纖維細胞，后者釋放大量ECM[1]，ECM過度沉積，導致肝纖維化。膽汁淤積會導致肝細胞損傷，損傷持續性存在可激活HSC,形成肝纖維化。VDR具有抗肝纖維化作用。DING等[15]研究發現：VDR可降低HSC中轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/Smad3 基因的表達，減輕肝纖維化；DURAN等[16]研究表明：重組人死骨片1(recombinant human sequestosome 1,rhSQSTM1)通過上調VDR抑制小鼠肝臟纖維化。然而，關于VDR抑制BDL導致的肝纖維化機制尚不清楚。隨著肝纖維化研究的深入，氧化應激與肝纖維化的關系逐漸受到重視。氧化應激造成過多ROS會刺激細胞引發脂質過氧化，使細胞的結構以及功能遭到破壞，造成肝細胞損傷及炎癥反應，OGG1是氧化應激的標志蛋白[14]，其表達水平變化可以反映機體的氧化應激情況。QUE等[17]發現：ROS 會通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，引發HSC的活化，導致肝纖維化。此外，VDR具有抗氧化應激的作用，如VDR抑制肝臟缺血再灌注小鼠氧化應激反應[18]；抑制多肽脯氨?；樂串悩嬅附閷У木€粒體氧化應激來預防糖尿病內皮功能障礙[19]；上調核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)，抑制氧化應激誘導的細胞衰老[20]。然而，VDR是否通過調控BDL小鼠的氧化應激緩解肝纖維化的情況尚不清楚。

VDR是核激素受體超家族的一員,可與帕立骨化醇特異性結合[21]。VDR與維生素D的活性形式結合后，從細胞質進入細胞核，與維生素D受體反應原件(vitamin D receptor elements,VDREs)結合，調控靶基因[22]。在肝臟中，VDR表達于肝非實質細胞，如膽管上皮細胞、HSC和Kupffer細胞[23-25]。VDR在靜息HSC中表達量很高，而當HSC被激活時VDR表達量可降低。向激活的HSC中加入1,25 (OH)2-D3可刺激VDR的表達, 導致HSC趨于靜息狀態[2]。本研究結果顯示：與模型組比較，治療組小鼠肝組織中α-SMA和Col Ⅰ蛋白表達水平降低，表明激活的VDR可抑制HSC的激活。本研究中，HE染色和天狼猩紅染色顯示：與模型組比較，治療組小鼠肝損傷和纖維化程度明顯減輕；DHE染色結果顯示：與模型組比較，治療組小鼠肝組織DHE紅色熒光的強度較強。DHE可透過細胞膜進入細胞內，并被細胞內的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產生紅色熒光[10]，根據紅色熒光的強度可以判斷細胞ROS水平。本研究結果表明：氧化應激和肝纖維化有密切關聯，激活VDR可抑制氧化應激導致的肝纖維化。

Sirt3是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (nicotinamide-adenine dinucleotide，NAD) 依賴的Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylase，HDAC),主要定位于細胞線粒體[26]。研究[5]顯示：VDR上調線粒體Sirt3蛋白的表達，抑制骨骼肌氧化應激反應。CHENARI等[27]研究發現：Sirt3抑制氧化應激反應，緩解肝硬化。但尚無文獻證明激活的VDR可以通過上調Sirt3蛋白抑制氧化應激。研究[28-30]表明：Sirt3能直接與超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)的乙酰化位點結合,使SOD2去乙?；?增加SOD2活性,形成重要的Sirt3-SOD2抗氧化通路 。此外，Sirt3刺激異檸檬酸轉化為α-酮戊二酸, 使NAD磷酸化水平和線粒體中還原氧化型谷胱甘肽的比例增加, 保護細胞免受氧化應激的損傷[31]。本實驗結果顯示：Sirt3蛋白表達水平，BDL可導致小鼠肝組織中Sirt3蛋白表達水平降低，激活的VDR可以調Sirt3蛋白表達水平，同時降低OGG1表達，表明激活的VDR可抑制氧化應激反應，其機制是上調Sirt3蛋白。

本研究結果表明：在BDL小鼠模型中，激活的VDR通過上調Sirt3蛋白表達進而抑制氧化應激誘導的肝纖維化。因此，VDR激活將為肝纖維化的治療提供一種新的思路。