用Morris水迷宮分析銀杏葉提取物干預的乏運動大鼠的學習和記憶能力〔1〕

魏攀鳳，程晶

(泉州醫學高等專科學校，福建 泉州 362000)

體力活動缺乏綜合征(SSeDS)最早出現在美國的醫學和體育研究的文獻中，也可以翻譯成“久坐生活方式致死癥”，它是一種慢性的由于運動缺乏引起的疾病，會增加其他疾病死亡率和致殘率，甚至引起一些可預防疾病的出現。影響的范圍遍布全球，特別是科技進步的現代社會，人們依靠機械電子改變了原來的生活方式，節省了盡可能多的體力活動，使SSeDS成為影響公眾健康的重要因素[1]。美國克利夫蘭診所研究小組發表的一項研究稱，久坐不動、運動能力缺乏、不愿意消耗體力比吸煙和糖尿病、心臟病對健康危害更大[2]。全球死亡的危險因素中缺乏運動已成為全球第四位的主要危險因素，占6%。相關研究認為，乳腺癌、直腸癌、糖尿病、心臟病都與缺乏運動有關，特別是缺血性心臟病，30%的患者可以歸結為缺乏運動[3]。因此，我們通過建立動物模型，研究缺乏運動對大鼠的影響，并通過銀杏葉提取物的干預療法觀察Morris水迷宮實驗中大鼠學習和認知能力的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

經過動物倫理委員會批準，選擇有資質的上海斯萊克動物實驗有限責任公司提供的24只雄性SPF級別的SD大鼠，飼養于泉州醫學高等專科學校SPF動物實驗室內。

1.2 動物模型的建立

將24只大鼠隨機分成正常組、乏運動組和銀杏葉提取物干預組(干預組)，每組8只。正常組每4只放入535 mm×390 mm×200 mm籠子內，配304不銹鋼網蓋一個，雙水瓶喂養，保證有足夠的活動空間和食物及水。乏運動組和干預組單只單獨關入285 mm×178 mm×150 mm籠子內，配一個304不銹鋼網蓋，單瓶水喂養，只保證能夠翻身及足夠的吃食和水，干預時間為8周，后按照6 mg/kg對干預組大鼠腹腔注射給藥(銀杏葉提取物)，單只給藥不超過1 mL，其余給予相應劑量的生理鹽水。8周后測量三組大鼠在Morris水迷宮中尋找相應位置平臺的能力及撤離平臺后還能到達相應位置的空間記憶能力。

1.3 實驗藥物

銀杏葉提取物注射液(金納多)，每支含有銀杏葉提取物17.5 mg，其中銀杏黃酮苷4.2 mg。輔料為山梨醇、乙醇、氫氧化鈉。批準文號：HC20090014。生產企業：臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司。規格為5 mL：17.5 mg×10支。

1.4 實驗儀器

SuperMaze Morris 水迷宮視頻分析系統。

1.5 行為學檢測

Morris水迷宮試驗：將大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機，可以取60°，120°，180°，360°的角為起始位置，開始60 s的引導實驗，如果大鼠在60 s內找不到平臺則引導大鼠到達平臺，并在平臺上停留10 s。每只每天訓練4次，每次訓練時間間隔為15～20 min，連續訓練4 d。第5天開始，將平臺撤除，將動物由原先的4個位置放入水中。記錄動物在水中的活動軌跡、進入平臺位置所花的時間及撤掉平臺后大鼠進入平臺范圍內的次數，以此作為空間記憶的檢測指標。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮運動軌跡

正常組、乏運動組、干預組的運動軌跡見圖1～圖3。在引導實驗中乏運動大鼠的軌跡分布在4個象限內，密集遍布整個水池；正常組的軌跡相對集中在平臺所在的第一象限內，軌跡相對稀疏；銀杏葉提取物干預后的大鼠在水池內的活動軌跡相對于乏運動大鼠更為稀疏。

圖1 正常組運動軌跡

圖2 乏運動組運動軌跡

圖3 干預組運動軌跡

2.2 到達Morris水迷宮平臺次數

前面4 d為引導實驗，大鼠到達平臺結束錄影。正常組60 s內都能找到平臺，乏運動組結束錄影還未能找到平臺的只數多于干預組。第五天開始記錄鼠的空間記憶能力即經過平臺范圍的次數。發現正常組立刻就能通過平臺區域；乏運動組個別停止活動靜止漂浮水面，個別老鼠無規律大范圍游動；干預組明顯有尋找平臺的行為，并且通過平臺區域的次數較多(見圖4)。

圖4 三組大鼠在水迷宮中到達平臺的次數

3 討 論

我們通過籠子限制大鼠的活動范圍，建立缺乏運動的模型，而后讓其進入水迷宮中，觀察大鼠的行為學變化即學習和記憶能力。在時代發展的電子化社會環境下，電子設備替代大部分的手動作業導致人體活動能力缺乏，運動量明顯減低。大量研究分析證實，缺乏運動對于人類來說增加了罹患心肌梗塞、心絞痛、心律失常、結腸癌、乳腺癌的風險。缺乏運動已經被世界衛生組織列入十大死亡的風險因素[4-6]。Laufs等[7]首先通過動物實驗證實，乏運動有別于傳統心血管疾病風險因子，如氧化應激、炎癥反應等，能引起動脈內皮細胞功能受損。本研究在前期研究中，只對大鼠進行限制活動這個單一的干預，模擬了人類久坐缺乏運動的生活方式以及有中等強度的有氧運動模式，揭示其不同運動量對于無基礎疾病狀態下大鼠在水迷宮中的空間學習和記憶能力的影響。研究發現乏運動組的大鼠內皮依賴性舒張功能下降，同時一氧化氮合成酶(eNOS)表達下調。在多普勒超聲檢測中，我們發現乏運動組腹主動脈血管壁順應性降低[8]。自20世紀60年代，德、法兩國科學家率先從中國古老樹種——銀杏的樹葉里提取出具有抗心腦血管疾病的成分(銀杏黃酮與銀杏內酯)，以“梯保寧”和“金納多”為代表的銀杏葉制劑在國際醫藥市場上聲譽鵲起。據美國經濟學家估計，目前全球各種銀杏葉制劑加上形形色色的銀杏保健食品與含銀杏葉提取物成分的化妝品等市場總銷售額已超過50億美元。由于銀杏葉提取物(EGB)具有明顯的抗氧化、改善微循環及腦保護等作用，臨床上常用于輔助治療糖尿病、心腦血管疾病、血管性癡呆等[9]。

陳紅輝等[10]建立老齡癡呆大鼠模型，研究發現銀杏葉提取物可改善學習記憶能力。我們通過水迷宮實驗發現了大鼠在運動缺乏狀態下的行為偏激且敏感和焦慮，而正常大鼠在學習記憶力上遠遠優于缺乏運動的大鼠，值得一提的是銀杏葉提取物干預后大鼠的學習記憶能力明顯不同于缺乏運動大鼠。本研究為以后的實驗提供了新的依據，初步揭示銀杏葉提取物改善久坐乏運動大鼠行為學的作用機制。該項目的成功實施有利于銀杏葉提取物藥用價值的開發，為銀杏葉提取物在臨床用藥提供了理論基礎。