5-羥基-1-甲基海因對百草枯中毒所致肺損傷保護作用的代謝組學研究

高利娜，王光，袁慧雅，劉俊亭

（中國醫科大學 1.法醫學院法醫毒物分析教研室；2.實驗動物部，沈陽 110122）

5-羥基-1-甲基海因 （5-hydroxy-1-methylhydantoin，HMH） 是內源性的抗氧化劑［1-2］，能夠清除羥基自由基，抑制慢性腎臟疾病的進展，對高糖和緩激肽刺激的血管提供保護，改善血管損傷和重構［3-5］。百草枯 （paraquat，PQ） 是廣泛應用的非選擇性廣譜除草劑，具有極強的毒性，口服中毒致死率為60%～80%［6-7］。PQ的中毒機制不清，多認為其肺損傷機制主要是線粒體功能障礙及氧自由基損傷［8］。前期研究［9-10］發現，HMH可通過其抗氧化特性保護PQ所致腎損傷。PQ中毒的靶器官是肺臟，中毒后可出現呼吸窘迫，中毒者多死于急性肺損傷及中毒后進行性肺纖維化。本研究擬通過檢測超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD） 活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 含量、血紅素氧合酶1 （heme oxygenase-1，HO-1） 及代謝產物，探討HMH對PQ中毒模型小鼠肺組織的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：HMH （上海一研生物技術有限公司），PQ （麥克林上海生物有限公司），SOD活性檢測試劑盒 （碧云天生物試劑有限公司），MDA檢測試劑盒 （貝博生物試劑有限公司），山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、小鼠抗β-actin單克隆抗體 （中杉金橋生物科技公司），ECL發光液、BCA蛋白定量試劑盒、HO-1兔多克隆抗體 （武漢三鷹生物技術有限公司）。

1.1.2 實驗動物分組及模型制備：SPF級4周齡雄性昆明小鼠30只，體質量 （30±2） g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物合格證號SYXK （遼）2018-0008。采用隨機數字表法將小鼠分為生理鹽水（NS） 組、PQ組、HMH組，每組10只。采用PQ一次性灌胃 （20 mg/kg） 制備PQ中毒動物模型；NS組灌胃等量生理鹽水；HMH組于造模后每天同一時間腹腔注射HMH （100 mg/kg），連續5 d。于第6天處死全部小鼠，留取肺組織備檢。本研究中動物處置符合動物倫理學標準，獲得中國醫科大學實驗動物福利與倫理委員會審批 （審批號2018072）。

1.2 方法

1.2.1 肺組織形態學觀察：4%多聚甲醛固定肺組織48 h，脫水、浸蠟、包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察肺組織形態學改變。

1.2.2 肺組織MDA含量及SOD活性測定：冰浴狀態下剖取肺組織，搗碎勻漿，按照試劑盒說明書操作檢測肺組織中MDA含量及SOD活性。

1.2.3 Western blotting檢測肺組織中HO-1蛋白表達：提取肺組織胞質蛋白20 μg，煮沸5 min變性，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，用TBST洗滌3次，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入一抗 （1︰1 000），4℃搖床過夜，洗滌3次，加入二抗 （1︰3 000） 室溫孵育2 h，洗滌3次后，采用化學發光試劑檢測，圖像分析系統定量分析，以目的蛋白與內參β-actin的灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.2.4 液相色譜質譜聯用檢測肺組織代謝產物：取0.1 mg肺組織 （液氮研磨） 置于EP管中，加入80%甲醇水溶液400 μL （4倍體積甲醇），渦旋震蕩，置-20℃靜置60 min，14 000g、4 ℃離心20 min，取上清液置于1.5 mL離心管中，真空冷凍干燥，將殘留物溶于100 μL復溶劑，渦旋振蕩，14 000g、4 ℃離心15 min，取上清液進行LC-MS分析。色譜條件：色譜柱Accucore HILIC column，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min。正模式：流動相A （0.1%甲酸，95%乙腈，10 mmol/L醋酸銨），流動相B （0.1%甲酸，50%乙腈，10 mmol/L醋酸銨）。負模式：流動相A （95%乙腈，10 mmol/L醋酸銨，pH9），流動相B （50%乙腈，10 mmol/L 醋酸銨，pH9）。色譜梯度洗脫程序：0～1 min，A%︰B%=98︰2；17～17.5 min，A%︰B%=50︰50；18～20 min，A%︰B%=98︰2。質譜條件：掃描范圍選擇m/z 100～1 500；ESI源設置為噴霧電壓3.2 kV；鞘氣流速35 arb；尾氣流速10 arb；毛細管溫度320 ℃。正負模式下掃描。MS/MS掃描為數據依賴性全掃描。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組肺組織病理改變

光鏡下可見，NS組肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺血管規則，無明顯炎癥細胞浸潤 （圖1A）。PQ組肺泡結構紊亂，肺間質明顯增加，肺泡內可見水腫液，肺血管內皮腫脹、出血，可見炎癥細胞浸潤，部分肺泡腔形成透明膜 （圖1B）；HMH組肺泡水腫及炎癥細胞浸潤明顯減輕，少量炎性滲出及出血 （圖1C）。

圖1 光鏡下觀察各組大鼠肺組織病理改變 HE ×200Fig.1 Pathological changes of lung tissues in each group were observed under light microscope HE ×200

2.2 各組肺組織SOD活性及MDA含量

與NS組比較，PQ組和HMH組肺組織MDA含量均顯著升高 （均P< 0.001），SOD活性均顯著下降 （均P< 0.001）；且HMH組MDA含量低于PQ組，SOD活性高于PQ組，差異均有統計學意義 （均P< 0.001）。見表1。

2.3 各組肺組織HO-1蛋白表達變化

與NS組比較，PQ組和HMH組肺組織HO-1表達水平均增高，且PQ組表達水平高于HMH組，差異均有統計學意義 （均P< 0.001）。見圖2。

2.4 代謝組學分析結果

2.4.1 差異代謝產物火山圖：在質譜儀的正負離子模式下觀察代謝產物的變化情況，如圖3所示，在質譜儀的正模式下，篩選出87個具有顯著性差異的代謝物；在質譜儀的負離子模式下，篩選出59個顯著性差異代謝物 （P< 0.05，VIP> 1）。

表1 各組肺組織SOD活性、MDA和HO-1蛋白含量比較Tab.1 Comparison of SOD activity，MDA content and HO-1 protein in lung tissues of each group

圖2 Western blotting檢測各組小鼠肺組織HO-1蛋白表達Fig.2 HO-1 protein expression in lung tissues of mice in each group was detected by Western blotting

2.4.2 PCA和PLS-DA：為了得到有意義的統計結果，進行了PCA及PLS-PCA。結果如圖4、5所示，HMH組和PQ組均在95%置信區間里得到很好的分離。

2.4.3 差異代謝產物：如表2所示，HMH組和PQ組間的差異代謝產物代謝通路主要集中于檸檬酸循環、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、微生物代謝、脂肪細胞脂解調控、嘌呤嘧啶代謝。

3 討論

圖3 差異代謝物火山圖Fig.3 The volcano map of different metabolites

圖4 主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis diagram

肺臟是PQ中毒主要的靶器官，經肺臟攝取PQ后發生氧化還原反應，干擾線粒體電子傳遞，產生大量氧自由基，誘發脂質過氧化損傷［9］。PQ進入體內后以原型形式經腎排泄，在腎臟濃度最高，導致腎臟功能受損，使PQ不能被正常排泄，在體內進一步蓄積，從而累及肝、心、肺等其他器官，導致多器官功能衰竭［11-12］。

圖5 偏最小二乘法-判別分析圖Fig.5 Partial least squares-discriminant analysis diagram

表2 HMH組和PQ組間的差異代謝產物Tab.2 The differential expression metabolites between the HMH group and the PQ group

肌酐是肌酸以恒定速率產生的降解產物，在腎功能受損時，肌酐大量蓄積后代謝產生HMH。HMH是一種抗氧化劑，能消除羥基自由基［1-2］。本研究發現，PQ中毒模型小鼠肺組織抗氧化應激指標MDA含量顯著升高，而SOD活性顯著下降。與PQ組相比，HMH組MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，提示HMH對PQ中毒所致肺損傷有保護作用。

HO-1是一種應激蛋白和內源性保護因子，是細胞對抗氧化應激反應的重要組成部分，在抗氧化應激、抗炎等方面起著重要作用［13-14］。研究［13］發現，PQ中毒小鼠肺組織中HO-1蛋白表達升高。邱俏檬等［15］發現，血必凈注射液治療可提高硫化氫中毒大鼠肺組織HO-1蛋白活性，減輕肺損傷。本研究結果顯示，HO-1在PQ中毒小鼠肺組織中表達增加，而HMH組HO-1水平較PQ組顯著增高。因此，推測HMH通過激活HO-1蛋白表達發揮抗氧化應激作用。

天冬氨酸普遍存在于生物合成作用中，是生物體內賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體。研究［16］顯示，氧化應激反應使N-乙酰天冬氨酸濃度降低。HMH組N-乙酰-L-天冬氨酸水平和谷氨酸含量較PQ組增高，猜測谷氨酸可能改善PQ中毒所致氧化損傷。與PQ組相比，HMH組嘧啶代謝相關產物增加，黃嘌呤含量降低，提示HMH能調節PQ導致的嘧啶嘌呤代謝紊亂；研究［17］顯示，5’-磷酸腺苷誘導低溫發揮抗炎功能，HMH組5’-磷酸腺苷水平升高，推測HMH能抑制炎癥的發生發展。前列腺素是二十碳不飽和脂肪酸花生四烯酸經酶促代謝產生的一類脂質介質，HMH組的前列腺素G水平較PQ組下降，提示中毒模型小鼠肺組織炎癥減輕。吡哆酸是維生素B6的代謝產物，維生素B6是抗氧化物質［18］，HMH組吡哆酸低于PQ組，推測維生素B6與過氧化物發生反應，從而防護PQ造成的氧化損傷。亞牛磺酸在體內可與過氧化物反應生成?；撬?，次?；撬崾呛芎玫目寡趸镔|［19-20］。HMH組亞?；撬岷扛哂赑Q組，猜測HMH能防護PQ引發的氧化自由基損傷。皮質甾酮參與細胞脂質氧化代謝和醛固酮合成與分泌，HMH組皮質甾酮含量下降，說明脂質過氧化水平減弱，醛固酮水平降低，這與研究［5］報道的HMH能夠平緩血管平滑肌作用一致。硫代苯甲酰胺二硫化物是氨基苯甲酸的降解產物，與磷酸乙酸共同參與微生物代謝，故推測HMH組可能通過影響微生物代謝，從而對機體代謝產生影響，改善PQ導致的脂質過氧化反應。

總之，HMH能顯著降低PQ中毒模型小鼠肺組織MDA水平，增加SOD活性及HO-1蛋白表達，糾正PQ導致的TCA循環、嘧啶嘌呤類物質代謝、氨基酸代謝紊亂和脂質過氧化損傷，減輕PQ所致炎癥反應。因此，HMH可作為防護PQ中毒損傷的替代治療藥物。